Actividad antagónica de levaduras Killer contra Alternaria spp. in vitro.

Un total de 24 cepas de levaduras con el fenotipo killer (varias especies) fueron analizadas in vitro para detectar su actividad antagónica contra seis cepas diferentes de Alternaria spp. aisladas de muestras vegetales infectadas con este patógeno considerado como el agente causal de la enfermedad del “punto negro” en solanáceas y del “tizón temprano” en cultivos de la papa y el tomate. Seis cepas de levaduras produjeron una reducción significativa del micelio de Alternaria spp.; cuatro de ellas pertenecientes al género Pichia guilliermondii y una a Pichia kluyveri (dos cepas aún no se han identificado). Especialmente P. kluyveri mostró una reducción del crecimiento micelial del hongo en un porcentaje mayor al 50% en todas las cepas del hongo y la cepa VG032 mostró un buen poder de inhibición al tener un porcentaje de reducción ≥45 en cuatro cepas de Alternaria spp., estos resultados indican que algunas cepas de levaduras poseen toxinas que se pueden utilizar como agentes de biocontrol contra Alternaria spp. y así evitar la contaminación producida por fungicidas y agentes químicos

Actividad antagónica de levaduras Killer frente ahongos del género Aspergillus sección nigri.

Una batería de 50 cepas de levaduras obtenidas de diversas fuentes naturales fue evaluada para detectar su fenotipo killer, probando cada cepa contra las 49 restantes. Se encontraron 25 cepas killer, que fueron probadas de forma cualitativa contra 10 cepas de Aspergillussección nigri, depositando alícuotas de 15µl de 105 células/mL en agar PDA previamente embebido con una concentración de 105 conidias/mL. Las placas se incubaron por 5 días a 25°C. Las cepas de levadura que inhibieron a 5 o más cepas de Aspergillus, fueron seleccionadas para establecer el porcentaje de reducción de crecimiento radial de dichos mohos. Para esto, se inocularon placas de PDA con las cepas de Aspergillus en el centro, flanqueadas por 2 estrías lineales paralelas de cada levadura. Después de incubar se midieron los diámetros coloniales en 2 ejes, incluyendo al control, para calcular la reducción de crecimiento en términos de porcentaje. El promedio de reducción varió entre 28 a 44%, siendo la levadura 1025 la más efectiva. La cepa M4 fue la que resultó con una menor inhibición, mientras que la cepa 117 fue la más susceptible. Esto demuestra el potencial de las levaduras killer en el biocontrol de alimentos en poscosecha

Aislamiento de Levaduras Killer en Alimentos.

Las levaduras killer, se caracterizan por secretar una toxina proteica, llamada “toxina killer” que es letal para cepas sensibles de su misma especie o especies de diferentes géneros, pero siendo ellas mismas inmunes a sus propias toxinas. Estas pueden ser utilizadas como biocontrol en la poscosecha de alimentos. Se tomaron muestras de tepache y queso fresco del cual se aislaron 7 y 8 levaduras en el medio YEPD (Extracto de levadura, peptona, dextrosa y agar bacteriológico) se incubaron a 25ºC por 48h. Se realizó el ensayo Killer para dichas levaduras en placas con agar YEPD-MB (Extracto de levadura, peptona, dextrosa, agar bacteriológico con azul de metileno), realizando 8 divisiones en la placa cada levadura susceptible del panel se inoculó a manera de césped (ATCC26609, Ca023, VG028, Derma5, RG001 y WG002) para posteriormente agregar en cada división una levadura aislada y la levadura control LALVIN (Killer) y se incubaron a 25ºC por 48 horas. Obteniendo 6 levaduras con el fenotipo Killer para el tepache y 7 levaduras en el queso fresco, la conservación de las cepas se llevó a cabo en tubos falcón con una solución de glicerol 20% y agua destilada 80%. Posteriormente permanecenen congelación a 4º C

Optimization of killer assays for yeast selection protocols Optimización de la actividad killer para protocolos de selección de levaduras

A new optimized semiquantitative yeast killer assay is reported for the first time. The killer activity of 36 yeast isolates belonging to three species, namely, Metschnikowia pulcherrima, Wickerhamomyces anomala and Torulaspora delbrueckii, was tested with a view to potentially using these yeasts as biocontrol agents against the wine spoilage species Pichia guilliermondii and Pichia membranifaciens. The effectiveness of the classical streak-based (qualitative method) and the new semiquantitative techniques was compared. The percentage of yeasts showing killer activity was found to be higher by the semiquantitative technique (60%) than by the qualitative method (45%). In all cases, the addition of 1% NaCl into the medium allowed a better observation of the killer phenomenon. Important differences were observed in the killer capacity of different isolates belonging to a same killer species. The broadest spectrum of action was detected in isolates of W. anomala NPCC 1023 and 1025, and M. pulcherrima NPCC 1009 and 1013. We also brought experimental evidence supporting the importance of the adequate selection of the sensitive isolate to be used in killer evaluation. The new semiquantitative method proposed in this work enables to visualize the relationship between the number of yeasts tested and the growth of the inhibition halo (specific productivity). Hence, this experimental approach could become an interesting tool to be taken into account for killer yeast selection protocols.En este trabajo se presenta un nuevo ensayo semicuantitativo que optimiza la detección de actividad killer en levaduras. Se evaluó la actividad killer de 36 cepas pertenecientes a las especies Metschnikowia pulcherrima, Wickerhamomyces anomala y Torulaspora delbrueckii, en vista del potencial uso de estas levaduras como agentes de biocontrol frente a las especies contaminantes de vinos Pichia guilliermondii y Pichia membranifaciens. Se comparó la efectividad de la técnica clásica basada en estrías (método cualitativo) con la del nuevo método semicuantitativo. El porcentaje de levaduras que mostraron actividad killer fue más alto cuando se utilizó el método semicuantitativo (60%) que con el método cualitativo (45%). En todos los casos, el agregado de 1% de NaCl en el medio permitió una mejor observación del fenómeno killer. Se observaron importantes diferencias en la capacidad killer de diferentes cepas dentro de la misma especie. Se detectaron dos cepas de W. anomala (NPCC 1023 y 1025) y dos cepas de M. pulcherrima (NPCC 1009 y 1013) con un amplio espectro de acción, ya que fueron capaces de inhibir el desarrollo de las tres levaduras sensibles evaluadas. La evidencia experimental demuestra la importancia de una adecuada selección de la cepa sensible al evaluar la actividad killer. El nuevo método semicuantitativo propuesto en este trabajo permite visualizar la relación entre el número de levaduras sembradas y el halo de inhibición del crecimiento (productividad específica). En conclusión, este método resulta una herramienta interesante para ser tenida en cuenta en los protocolos de selección de levaduras killer

Killer phenotype of indigenous yeasts isolated from Argentinian wine cellars and their potential starter cultures for winemaking

Of 31 yeasts, from different surfaces of two cellars from the northwest region of Argentina, 11 expressed killer activity against the sensitive strain Saccharomyces cerevisiae P351. Five of these killer yeasts were identified as S. cerevisiae by phenotypic tests and PCR-RFLP analysis. Two S. cerevisiae killer strains, Cf5 and Cf8, were selected based on their excellent kinetic and enological properties as potential autochthonous mixed starter cultures to be used during wine fermentation. They could dominate the natural microbiota in fermentation vats and keep the typical sensorial characteristics of the wine of this region.Fil: Fernandez de Ullivarri, Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Centro de Referencia para Lactobacilos; ArgentinaFil: Mendoza, Lucia Margarita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Centro de Referencia para Lactobacilos; ArgentinaFil: Raya, Raul Ricardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Centro de Referencia para Lactobacilos; ArgentinaFil: Farias, Marta Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Centro de Referencia para Lactobacilos; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia; Argentin

Identification and susceptibility of clinical isolates of Candida spp. to killer toxins

Abstract Although invasive infections and mortality caused by Candida species are increasing among compromised patients, resistance to common antifungal agents is also an increasing problem. We analyzed 60 yeasts isolated from patients with invasive candidiasis using a PCR/RFLP strategy based on the internal transcribed spacer (ITS2) region to identify different Candida pathogenic species. PCR analysis was performed from genomic DNA with a primer pair of the ITS2-5.8S rDNA region. PCR-positive samples were characterized by RFLP. Restriction resulted in 23 isolates identified as C. albicans using AlwI, 24 isolates as C. parapsilosis using RsaI, and 13 as C. tropicalis using XmaI. Then, a group of all isolates were evaluated for their susceptibility to a panel of previously described killer yeasts, resulting in 75% being susceptible to at least one killer yeast while the remaining were not inhibited by any strain. C. albicans was the most susceptible group while C. tropicalis had the fewest inhibitions. No species-specific pattern of inhibition was obtained with this panel of killer yeasts. Metschnikowia pulcherrima, Pichia kluyveri and Wickerhamomyces anomalus were the strains that inhibited the most isolates of Candida spp

Production of functional killer protein in batch cultures upon a shift from aerobic to anaerobic conditions

The aim of this work was to study the production of functional protein in yeast culture. The cells of Saccharomyces cerevisiae Embrapa 1B (K+R+) killed a strain of Saccharomyces cerevisiae Embrapa 26B (K-R-)in grape must and YEPD media. The lethal effect of toxin-containing supernatant and the effect of aeration upon functional killer production and the correlation between the products of anaerobic metabolism and the functional toxin formation were evaluated. The results showed that at low sugar concentration, the toxin of the killer strain of Sacch. cerevisiae was only produced under anaerobic conditions . The system of killer protein production showed to be regulated by Pasteur and Crabtree effects. As soon as the ethanol was formed, the functional killer toxin was produced. The synthesis of the active killer toxin seemed to be somewhat associated with the switch to fermentation process and with concomitant alcohol dehydrogenase (ADH) activity