Sorogrupos e genes de virulência em Escherichia coli isoladas de psitacídeos

Escherichia coli isolates from 24 sick psittacine birds were serogrouped and investigated for the presence of genes encoding the following virulence factors: attaching and effacing (eae), enteropathogenic E. coli EAF plasmid (EAF), pili associated with pyelonephritis (pap), S fimbriae (sfa), afimbrial adhesin (afa), capsule K1 (neu), curli (crl, csgA), temperature-sensitive hemagglutinin (tsh), enteroaggregative heat-stable enterotoxin-1 (astA), heat-stable enterotoxin -1 heat labile (LT) and heat stable (STa and STb) enterotoxins, Shiga-like toxins (stx1 and stx2), cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1), haemolysin (hly), aerobactin production (iuc) and serum resistance (iss). The results showed that the isolates belonged to 12 serogroups: O7; O15; O21; O23; O54; O64; O76; O84; O88; O128; O152 and O166. The virulence genes found were: crl in all isolates, pap in 10 isolates, iss in seven isolates, csgA in five isolates, iuc and tsh in three isolates and eae in two isolates. The combination of virulence genes revealed 11 different genotypic patterns. All strains were negative for genes encoding for EAF, EAEC, K1, sfa, afa, hly, cnf, LT, STa, STb, stx1 and stx2. Our findings showed that some E. coli isolated from psittacine birds present the same virulence factors as avian pathogenic E. coli (APEC), uropathogenic E. coli (UPEC) and Enteropathogenic E. coli (EPEC) pathotypes.Amostras de Escherichia coli isoladas de 24 psitacídeos doentes foram sorogrupadas e investigadas para a presença de genes que codificam os seguintes fatores de virulência: attaching e effacing (eae), plasmídeo EAF (EAF), pili associado à pielonefrite (pap), fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), cápsula K1 (neu), curli (crl, csgA), hemaglutinina termosensível (tsh), enterotoxina termo-estável 1 de E. coli enteroagregativa (astA), toxina termolábil (LT) e toxina termoestável (STa e STb), Shiga-like toxinas (stx1 e stx2), fator citotóxico necrotizante 1 (cnf1), hemolisina (hly), produção de aerobactina (iuc) e resistência sérica (iss). Os resultados mostraram que os isolados pertenciam a 12 sorogrupos: O7; O15; O21; O23; O54; O64; O76; O84; O88; O128; O152 e O166. Os genes de virulência encontrados foram: crl em todos os isolados, pap em 10 isolados, iss em sete isolados, csgA em cinco isolados, iuc e tsh em três isolados e eae em dois isolados. A combinação dos genes de virulência revelou 11 perfis genotípicos distintos. Todas as amostras foram negativas para os genes que codificam EAF, EAEC, K1, sfa, afa, hly, cnf, LT, STa, STb, stx1 e stx2. Estes resultados demonstraram que algumas amostras de E. coli isoladas de psitacídeos apresentam os mesmos fatores de virulência presentes nos patotipos de E. coli patogênicas para aves (APEC), uropatogênicas (UPEC) e E. coli enteropatogênicas (EPEC).Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Faculdades Metropolitanas Unidas Laboratório de Epidemiologia e Doenças InfecciosasUniabc Faculdade de Medicina VeterináriaUniversidade de São Paulo Faculdade de Medicina Veterinária e ZootecniaUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de MedicinaUniversidade Estadual de Campinas Instituto de BiologiaUniversidade de Santiago de Compostela Facultad de Veterinaria Departamento de Microbiologia e ParasitologíaUNIFESP, EPMSciEL

Relation of antimicrobial sensitivity and presence of virulence factors Staphylococcus spp. isolated from bovine subclinical mastitis

FAPESP 2011/51483-

Detecção molecular de Escherichia coli enteropatogênica em psitacídeos assintomáticos em cativeiro

Psittaciformes are one of the most endangered groups of birds, and several Brazilian species are classified between vulnerable and critically endangered. It is thus necessary to identify agents that cause infections in captive wild animals and to assess the risks posed thereof and to design interventions to minimize the possibility of disease outbreaks, leading to the conservation of endangered species. The purpose of this study was to identify enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) cloacal isolates from asymptomatic psittacines in captivity and evaluate the distribution of the EPEC pathotype. Cloacal swabs were obtained from 46 asymptomatic birds, and resulting isolates were tested by polymerase chain reaction (PCR) for the presence of the attaching and effacing gene (eae) and bundle-forming pilus structural gene (bfpA) of EPEC. Samples from several species were tested, and three samples were found to be positive for the eae and bfpA genes and characterized as typical EPEC. This is the first report of this pathotype in asymptomatic psittacines. Although certain E. coli strains are more pathogenic than others, various factors should be considered when determining the potential of E. coli isolates to cause disease in captive psittacines. Birds that are positive for the EPEC (typical) strain could be zoonotic sources of infection, and may have acquired these strains through contact with humans or domestic animals. These findings may also be valuable for the long-term management of endangered species ex situ as one EPEC sample was isolated from a Red-tailed Amazon (Amazona brasiliensis).Os psitacídeos são um dos grupos de aves mais ameaçadas no mundo e diversas espécies brasileiras são classificadas desde vulneráveis à criticamente ameaçadas de extinção. Torna-se, portanto, necessário identificar os agentes que causam infecções em animais selvagens em cativeiro e determinar os riscos relacionados de modo a intervir sobre os fatores envolvidos para diminuir a possibilidade de surtos de doenças e promover a conservação de espécies ameaçadas. O objetivo deste estudo foi identificar Escherichia coli Enteropatogência (EPEC) de isolados cloacais de psitacídeos assintomáticos em cativeiro e avaliar a distribuição do patotipo EPEC. Suabes cloacais foram coletados de 46 psitacídeos assintomáticos e os isolados foram testados pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) para a presença do gene attaching and effacing (eae) e bundle forming pilus (bfpA) de EPEC. Amostras oriundas de diversas espécies foram testadas e três amostras resultaram positivas para os genes eae e bfp e caracterizadas como EPEC típicas. Esse é o primeiro relato em psitacídeos assintomáticos para esse patotipo. Apesar de que algumas cepas de E.coli serem mais patogênicas do que outras, diversos fatores devem ser considerados para determinar o potencial de isolados de E.coli de causar doença em psitacídeos em cativeiro. Aves positivas para cepas de EPEC (típicas) poderiam ser fontes de infecção zoonóticas e adquirir essas cepas através do contato com humanos e animais domésticos. Esses achados também podem ser valiosos para o manejo a longo prazo de espécies ameaçadas ex situ já que uma amostra de EPEC foi isolada de um Papagaio-de-cara-roxa (Amazona brasiliensis).Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) [2010/51015-0]Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP

Detection of Escherichia coli virulence factors isolated from psittacines with varied clinical signs

Os fatores de virulência presentes em Escherichia coli (E. coli) patogênicas vêm sendo estudados em diversas espécies animais devido à importância de algumas cepas. Estas podem ser classificadas em sorotipos ou mais recentemente através de patotipos, de acordo com algumas técnicas de biologia molecular. Os patotipos mais conhecidos atualmente incluem as ETEC, STEC, EPEC, EIEC, UPEC e APEC. Vários patotipos encontrados causando doenças em animais têm também afetado gravemente seres humanos. Diversas espécies de aves também revelaram possuir patotipos de E. coli capazes de causar infecções zoonóticas. Além do aspecto zoonótico, infecções por bactérias Gram-negativas em aves silvestres têm especial importância, pois o Taxon Psittacidae contém muitas das espécies que mais estão ameaçadas de extinção, e sua manutenção e reprodução em cativeiro é comprometida por infecções bacterianas constantes, em especial por E. coli. Nesse estudo 174 amostras de swabs cloacais de aves sintomáticas e assintomáticas e de casos de necropsias foram testadas através da técnica da PCR para a detecção de fatores de virulência e a classificação em grupos filogenéticos. Detectaram-se 93 amostras (53.45%) positivas para associações de fatores de virulência, em especial para os patotipos EPEC, APEC e UPEC e a classificação de grande parte das amostras de necropsias no grupo filogenético A. O gene iss foi encontrado com maior freqüência, sendo esta de 51.7% (n=30) nas aves sintomáticas e 23.2% (n=23) naquelas assintomáticas. Os resultados demonstraram serem de interesse não apenas com relação ao potencial zoonótico dessas aves em cativeiro, mas também para programas de conservação que visem à liberação de aves no meio selvagem.Virulence factors of pathogenic Escherichia coli (E.coli) have been studied in several animal species due the importance of certain strains. These strains can be classified in serotypes and more recently in pathotypes using molecular biology techniques. The mostly known pathotypes nowadays include ETEC, STEC, EPEC, EIEC, UPEC and APEC. Several pathotypes causing disease and found in animals are also linked to severe disease in humans. A number of bird species are also known to possess pathotypes able to cause zoonotic infections. Besides de zoonotic aspect, infections by Gram-negative bacteria have a special importance as the Taxon Psittacidae includes many of the most threatened species and their maintenance in captivity is compromised by constant bacterial infections, especially E.coli. In this study, 174 samples from cloacal swabs of asymptomatic and symptomatic birds and necropsy cases were tested employing the PCR technique to detect virulence factors and to classify among phylogenetic grups. Ninety three positive samples were detected for virulence factors associations, mostly EPEC, APEC and UPEC, and most of the necropsy samples for the phylogenetic group A. The iss gene was detected with a higher frequency in symptomatic birds (51.7%, n=30) and 23.2%, (n=23) in asymptomatic ones. The results reveal to be of interest not only to the zoonotic potential of the isolates but also for conservation programs that intend to release these birds into the wild

Health survey protocols for the Vinaceous Amazon (Amazona vinacea - Kuhl, 1820) in captivity and analysis of relocation projects

Um componente da conservação de animais selvagens é a relocação de espécies comumente referida como projetos de soltura. Para que esta seja bem sucedida os candidatos do projeto devem estar livres de patógenos considerados de importância para a espécie. Segundo a Instrução Normativa 179 oficializada pelo IBAMA em 25/06/2008, determinou-se a realização de exames laboratoriais como medidas a se prevenir a introdução de agentes infecciosos no ambiente, e garantir a sobrevivência a longo prazo dos animais em questão. No Brasil encontra-se a maior quantidade em espécies de psitacídeos, e das 84 espécies, 13 são vulneráveis a criticamente ameaçadas de extinção. Diversos projetos de relocação de animais silvestres, incluindo vários já bem sucedidos com psitacídeos, vêm sido realizados em território nacional além dos existentes do exterior. O Papagaio-de-peito-roxo (Amazona vinacea) tem suas populações severamente afetadas, sendo classificada no estado de São Paulo como criticamente ameaçada e como ameaçada a nível mundial. Apesar das dificuldades para a conservação dos recursos naturais, existem remanescentes de habitat protegido e em regeneração que podem abrigar espécies que historicamente ocupavam estes locais, de maneira que projetos de reintrodução visando A.vinacea como espécie bandeira em São Paulo e em Santa Catarina, foram contatados para realizar a pesquisa sanitária prévia à soltura. Foram realizados suabes cloacais em amostragens seriadas de modo a identificar possíveis portadores para os agentes paramixovírus tipo 1, influenza tipo A, poxvírus aviário, coronavírus, Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC), e Salmonella spp., em indivíduos da espécie confiscados do tráfico, através da reação em cadeia pela Polimerase (PCR), objetivando sequenciar os possíveis resultados positivos, discutindo a viabilidade e custos segundo as determinações da IN 179/2008. Amostras após a liberação também foram coletadas na forma de fezes obtidas no recinto de aclimatação e/ou ao redor dos comedouros de alimentação suplementar. Obtiveram-se um total de 151 amostras somadas em todas as coletas seriadas, sendo 103 amostras de suabes cloacais de aves ainda em cativeiro e 48 amostras de fezes não individualmente caracterizadas das aves soltas. Das amostras testadas para os agentes com potencial infeccioso obtiveram-se apenas resultados positivos para E.coli, totalizando 36 isolados, embora nenhum tenha sido caracterizado como EPEC. Observou-se uma tendência para maior detecção de E.coli nas amostragens iniciais em comparação com as finais, fato ligado principalmente às melhorias no manejo empregadas. A possibilidade de se comparar resultados em amostragens seriadas foi importante para uma avaliação mais segura quanto à sanidade dos animais envolvidos, auxiliando a determinar a seleção das aves, não havendo relatos de doenças imediatamente após a soltura ou no monitoramento a longo prazo. A baixa frequência de amostras positivas para os agentes que poderiam inviabilizar a liberação parece demonstrar que existe um exagero de que doenças representam um risco extremo impedindo projetos de relocação. Procedimentos de quarentena adequados e a realização de um mínimo de exames reduzem os riscos envolvidos, fato observado no presente estudo tanto em cativeiro como no processo de liberação e posteriormente. Para as instituições amostradas havia um limitado recurso anual que não seria capaz de pagar por exames individuais. Uma opção é a de testar amostras em pool para diminuir os custos, e caso haja positivos, procurar retestar para identificar os indivíduos. A baixa prevalência de positividade para os agentes com potencial infeccioso neste estudo, demonstra que amostras em pool podem ser uma alternativa econômica, caso o exame individual esteja fora de questão. Tendo em vista que para obter um mínimo de segurança no projeto de relocação no Brasil depende-se quase exclusivamente da iniciativa privada, convênios com universidades tornam-se não apenas uma necessidade, mas também uma oportunidade para troca em direção a um objetivo em comum e geração de conhecimento científico.One component in the conservation of wild animals is the relocation of species, commonly referred as release projects. In order for this attempt to be successful the candidates must be clear of pathogens of significance for the species. According to the normative rule 179 established by the IBAMA in 25/06/2008, it was determined that a series of laboratorial exams should be performed in order to prevent the introduction of infectious agents in the environment and guarantee the long term survival of the animals. The largest number of psittacine species is found in Brazil accounting for 84 species, with 13 of these classified as vulnerable to critically endangered. Several relocation projects with wild animals, including several well succeeded with psittacines have been taking place on a national scale besides others being carried out around the world. The Vinaceous Amazon (Amazona vinacea) have had its populations severely affected being classified as critically endangered in the state of São Paulo and globally threatened. Although there are challenges to conserve natural resources, available remnants of protected and regenerating habitat can be found and could support species that historically inhabited these sites, hence reintroduction projects with A.vinacea as a flagship species in the state of São Paulo and Santa Catarina were contacted to perform a health survey previously to the releases. Cloacal swabs were taken in paired samplings in order to detect possible carriers for paramyxovirus typ1, influenza type A, avian poxvirus, coronavirus, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), and Salmonella spp.; in individuals that were confiscated from the illegal trade employing the Polymerase Chain Reaction (PCR), aiming to sequence possible positive results and discussing the viability and costs according to the determination of the IN/179/2008. Fecal samples were also collected after the release in the acclimation flight and/or surrounding the supplemental feeders in the area while still adapting in the post-release. A total of 151 samples were obtained altogether with 103 of these being cloacal swabs of the birds still in captivity and 48 fecal samples non individually characterized of released birds. Out of the tested samples only E.coli yielded positive results with a total of 36 isolates, although none was characterized as EPEC. A tendency was observed for a higher detection of E.coli in the initial samplings compared to the final ones, a fact mainly connected husbandry improvements that were put in use. The possibility to compare results in paired samplings was important in order to obtain a safer evaluation concerning the health status of the animals, helping to determine the birds selection and no health problems reported neither immediately after the release nor on the long term monitoring. The low frequency of positive samples for the agents that could jeopardize a release seems to show that there is an exaggeration that diseases represent an extreme risk to the point of hampering relocation projects. Adequate quarantine procedures and performing minimum health examinations minimize the involved risks, a fact observed in this study both in captivity as well as in the release and post release process. For the studied institutions there was a limited annual budget that would not be capable to pay for individual exams. One option is to test pooled samples to lower associated costs, and if a positive is found, retest to identify the individuals. The low prevalence for the tested agents in this study show that pooled samples could be a viable alternative when individual exams are not feasible. Taking into account that to obtain a minimum in terms of safety for a relocation project in Brazil one is almost exclusively dependent on private parties, cooperation with universities are not only a necessity but also an opportunity for exchanges toward a common goal besides generating scientific knowledge

Genomic characterization of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) of avian origin and rabbit ileal loop response; a pet macaw (Ara chloropterus) as a possible zoonotic reservoir

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) constitutes one of the main causes of mortality in children in low- to medium-income countries. Diverse animal species have been linked as reservoirs, including birds. The aim of this study was to describe the genomic and phylogenetic features of an EPEC recovered from a pet macaw and further characterizing the macro and microscopic lesion in a rabbit ileal loop experimental model. The isolate was whole-genome sequenced (WGS) obtaining its genotypic and phenotypic in silico characteristics and inoculated in a rabbit experimental model with subsequently evaluating the strain's pathogenicity by scanning electron microscopy (SEM) and histopathology. The isolate was characterized as O109:H21-B1-ST40 typical EPEC, harboring several virulence factors of diarrheagenic E. coli. The macaw EPEC genome was located in a monophyletic clade of human and animal ST40 EPEC sequences. In vivo inoculation demonstrated severe hemorrhage with SEM and histopathological analysis confirming these lesions to be associated with intra-epithelial lymphocytes. Therefore, the isolate not only shared several genotypic and phylogenetic similarities with EPEC that affects humans and animals, but was able to induce severe tissue injury in a mammal model. These findings highlight the underrated role of pet birds as zoonotic reservoirs and the diversity in virulence factors being unraveled by new WGS studies

Antimicrobial Resistance and Pathogenicity of Aliarcobacter butzleri Isolated from Poultry Meat

Aliarcobacter butzleri (A. butzleri) is an emergent zoonotic food-related pathogen that can be transmitted through the consumption of poultry meat. Data regarding the pathogenicity and resistance of A. butzleri are still scarce, and the presence of virulent MDR strains of this zoonotic pathogen in poultry meat is an issue of particular concern to public health. This study aimed to characterize the pathogenicity and antimicrobial resistance profiles of A. butzleri strains isolated from poultry meat sold at retail markets in São Paulo, Brazil. The minimum inhibitory concentrations of 27 strains were determined using the broth microdilution method. The results showed that 77.7% of the isolates were resistant to clindamycin, 62.9% to florfenicol, 59.2% to nalidixic acid, 11.1% to azithromycin, 7.4% to ciprofloxacin and telithromycin, and 3.7% to erythromycin and tetracycline, although all were susceptible to gentamicin. Moreover, 55.5% of the virulent isolates were also multidrug-resistant (MDR). Three strains were selected for pathogenicity tests in vitro and in vivo. The tested strains expressed weak/moderate biofilm production and showed a diffuse adhesion pattern (3 h) in HeLa cells and toxicity in Vero cells (24 h). Experimental inoculation in 11-week-old chicks induced a transitory inflammatory enteritis. Intestinal hemorrhage and destruction of the intestinal crypts were observed in the rabbit ileal loop test. Considering the fact that Brazil is a major exporter of poultry meat, the data from this study point to the need of improvement of the diagnostic tools, as well as of the adoption of surveillance guidelines and more specific control strategies to ensure food safety, reducing the presence of pathogenic MDR strains in broilers

Antimicrobial Resistance and Pathogenicity of <i>Aliarcobacter butzleri</i> Isolated from Poultry Meat

Aliarcobacter butzleri (A. butzleri) is an emergent zoonotic food-related pathogen that can be transmitted through the consumption of poultry meat. Data regarding the pathogenicity and resistance of A. butzleri are still scarce, and the presence of virulent MDR strains of this zoonotic pathogen in poultry meat is an issue of particular concern to public health. This study aimed to characterize the pathogenicity and antimicrobial resistance profiles of A. butzleri strains isolated from poultry meat sold at retail markets in São Paulo, Brazil. The minimum inhibitory concentrations of 27 strains were determined using the broth microdilution method. The results showed that 77.7% of the isolates were resistant to clindamycin, 62.9% to florfenicol, 59.2% to nalidixic acid, 11.1% to azithromycin, 7.4% to ciprofloxacin and telithromycin, and 3.7% to erythromycin and tetracycline, although all were susceptible to gentamicin. Moreover, 55.5% of the virulent isolates were also multidrug-resistant (MDR). Three strains were selected for pathogenicity tests in vitro and in vivo. The tested strains expressed weak/moderate biofilm production and showed a diffuse adhesion pattern (3 h) in HeLa cells and toxicity in Vero cells (24 h). Experimental inoculation in 11-week-old chicks induced a transitory inflammatory enteritis. Intestinal hemorrhage and destruction of the intestinal crypts were observed in the rabbit ileal loop test. Considering the fact that Brazil is a major exporter of poultry meat, the data from this study point to the need of improvement of the diagnostic tools, as well as of the adoption of surveillance guidelines and more specific control strategies to ensure food safety, reducing the presence of pathogenic MDR strains in broilers