Mécanismes moléculaires de la réponse au stress salin de Sinorhizobium meliloti en symbiose avec Medicago sativa (caractérisation de transporteurs de proline bétaïne et analyse transcriptomique de bactéroïdes stressés in planta)

Un stress osmotique lié à la salinité des sols ou à des périodes de sécheresse est une contrainte environnementale majeure qui affecte plus de 40% des terres cultivées dans le monde, et engendre une importante diminution des rendements agricoles. Ce stress inhibe notamment la croissance de la luzerne, plante d'intérêt agronomique, et réduit en particulier l'efficacité de la symbiose fixatrice d'azote qu'elle établit avec la bactérie du sol S. meliloti. Comme chez la plante, on sait que chez la bactérie libre, un stress osmotique provoque l'accumulation de composés osmoprotectants, comme la proline bétaïne, et modifie l'expression de nombreux gènes. En revanche, l'existence de ces mécanismes moléculaires et leurs rôles dans l'adaptation au stress ne sont pas clairement établis chez le bactéroïde (forme différenciée de la bactérie dans la plante). Par conséquent, deux approches ont été menées afin de les préciser. Dans le cadre de la première approche, nous avons choisi d identifier des gènes de S. meliloti codant des systèmes de transport de proline bétaïne, puis d analyser leur rôle dans l accumulation de cette bétaïne lors de la symbiose en condition de stress. Ainsi dans un premier temps, nous avons caractérisé chez la bactérie libre deux nouveaux transporteurs. Le premier, nommé Prb, est un système de transport de type ATP binding cassette impliqué dans l osmoprotection par la proline bétaïne de la bactérie dans un milieu de haute osmolarité. Le second, BetX, est une protéine périplasmique capable de lier la proline bétaïne et de la transporter. Puis, dans un second temps, nous avons montré le rôle de ces transporteurs dans l accumulation de proline bétaïne au sein du bactéroïde lors de la symbiose soumise à un stress salin. La seconde approche a été menée en parallèle afin de préciser les régulations géniques du bactéroïde chez la plante stressée. Nous avons comparé l expression de l ensemble des gènes de bactéroïdes issus de plantes soumises à un stress salin à celle de bactéroïdes issus de plantes non stressées, par la technique de microarrays. Ainsi, l expression de 62 gènes bactéroïdiens apparaît modifiée en réponse au traitement salin de la plante hôte, dont 16 induits et 46 réprimés. L analyse in silico de la fonction de ces gènes permet de préciser, au niveau moléculaire, la nature des stress ressentis par le bactéroïde lors d une contrainte saline, responsable de la baisse de la fixation d azote. De plus, nous montrons pour la première fois que la diminution de l activité fixatrice d azote du bactéroïde est corrélée à une baisse de la transcription des gènes nif et fix, codant les enzymes nécessaires à la réduction de l azote atmosphérique. Enfin, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la baisse de la fixation d azote, une analyse fonctionnelle in vitro et in planta à l aide de mutants d insertion dans des gènes ayant été observé comme différentiellement exprimés a été également réalisée.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Proline Betaine Uptake in Sinorhizobium meliloti: Characterization of Prb, an Opp-Like ABC Transporter Regulated by both Proline Betaine and Salinity Stress

Sinorhizobium meliloti uses proline betaine (PB) as an osmoprotectant when osmotically stressed and as an energy source in low-osmolarity environments. To fulfill this dual function, two separate PB transporters, BetS and Hut, that contribute to PB uptake at high and low osmolarity, respectively, have been previously identified. Here, we characterized a novel transport system that mediates the uptake of PB at both high and low osmolarities. Sequence analysis of Tn5-luxAB chromosomal insertions from several PB-inducible mutants has revealed the presence of a four-gene locus encoding the components of an ABC transporter, Prb, which belongs to the oligopeptide permease (Opp) family. Surprisingly, prb mutants were impaired in their ability to transport PB, and oligopeptides were not shown to be competitors for PB uptake. Further analysis of Prb specificity has shown its ability to take up other quaternary ammonium compounds such as choline and, to a lesser extent, glycine betaine. Interestingly, salt stress and PB were found to control prb expression in a positive and synergistic way and to increase Prb transport activity. At low osmolarity, Prb is largely implicated in PB uptake by stationary-phase cells, likely to provide PB as a source of carbon and nitrogen. Furthermore, at high osmolarity, the analysis of prb and betS single and double mutants demonstrated that Prb, together with BetS, is a key system for protection by PB

Osmotically induced synthesis of the dipeptide N-acetylglutaminylglutamine amide is mediated by a new pathway conserved among bacteria

The dipeptide N-acetylglutaminylglutamine amide (NAGGN) was discovered in the bacterium Sinorhizobium meliloti grown at high osmolarity, and subsequently shown to be synthesized and accumulated by a few osmotically challenged bacteria. However, its biosynthetic pathway remained unknown. Recently, two genes, which putatively encode a glutamine amidotransferase and an acetyltransferase and are up-regulated by osmotic stress, were identified in Pseudomonas aeruginosa. In this work, a locus carrying the orthologous genes in S. meliloti, asnO and ngg, was identified, and the genetic and molecular characterization of the NAGGN biosynthetic pathway is reported. By using NMR experiments, it was found that strains inactivated in asnO and ngg were unable to produce the dipeptide. Such inability has a deleterious effect on S. meliloti growth at high osmolarity, demonstrating the key role of NAGGN biosynthesis in cell osmoprotection. β-Glucuronidase activity from transcriptional fusion revealed strong induction of asnO expression in cells grown in increased NaCl concentration, in good agreement with the NAGGN accumulation. The asnO–ngg cluster encodes a unique enzymatic machinery mediating nonribosomal peptide synthesis. This pathway first involves Ngg, a bifunctional enzyme that catalyzes the formation of the intermediate N-acetylglutaminylglutamine, and second AsnO, required for subsequent addition of an amide group and the conversion of N-acetylglutaminylglutamine into NAGGN. Interestingly, a strong conservation of the asnO–ngg cluster is observed in a large number of bacteria with different lifestyles, such as marine, symbiotic, and pathogenic bacteria, highlighting the ecological importance of NAGGN synthesis capability in osmoprotection and also potentially in bacteria host–cell interactions