Etude et caractérisation de l'état " Viable mais Non Cultivable " chez Brettanomyces, une levure d'altération des vins : nouvel outil de détection et de quantification spécifique de Brettanomyces en vin

The viable but not culturable (VBNC) state has been studied in detail in bacteria. It has been suggested that the VBNC state also exists in eukaryote cells, such as wine yeasts, including Brettanomyces in particular. We investigated the VBNC state in this yeast, focusing on the conditions for entry and exit, and the morphological and metabolic modifications associated with this state. We added sulfite (0.8 mg.L-1 molecular SO2) to induce the VBNC state. Increasing the pH of the medium inactivated the sulfite, allowing the cells to exit from the VBNC state and to become culturable again. In these conditions, we found that Brettanomyces VBNC cells were smaller than culturable cells, and that spoilage by volatile phenols could persist during VBNC state. Furthermore, according to our proteome comparison, it seems that the blockade of ATP synthesis was compensated by an increase in energy-producing metabolism pathway. This study provides the first insight into the VBNC state in eukaryote cells, showing common trend to the VBNC state of prokaryotic cells. The existence of VBNC state in Brettanomyces cells can also provoke errors of detection. A new tool of detection by fluorescence in situ hybridization and reading by flow cyometry was thus set up. This method allows the revealing of Brettanomyces cells presence in wine in an efficient and fast way.L'état Viable Non Cultivable (VNC) a été observé et décrit chez de nombreuses espèces bactériennes. Mais cet état métabolique a également été suggéré chez certaines cellules eucaryotes, et notamment chez les levures du vin comme Brettanomyces. L'état VNC chez cette levure a donc été étudié afin d'en déterminer les conditions d'entrée et de sortie, ainsi que les modifications morphologiques et métaboliques associées à cet état VNC. Une addition de sulfite (0,8 mg/L de SO2 moléculaire) induit un état VNC chez Brettanomyces, et une inactivation de ce sulfite par modification du pH du milieu permet une sortie de l'état VNC de la levure par un regain de cultivabilité. Dans les conditions VNC, la taille moyenne des cellules de Brettanomyces a été déterminée comme diminuée de 22% comparée à leur taille en condition contrôle. Ensuite, la capacité des cellules à produire des phénols volatils, éléments de contamination des vins, est conservée même lorsque les cellules sont en état Viable Non Cultivable. De plus, l'étude comparative des protéomes entre cellules de Brettanomyces témoin et cellules en état VNC montre une modification du métabolisme avec une diminution de la synthèse d'ATP compensée par une augmentation des protéines impliquées dans d'autres voies métaboliques de production d'énergie. Cette étude met donc en évidence pour la première fois l'existence de l'état VNC chez une espèce eucaryote et montre des points communs avec l'état VNC chez les cellules procaryotes. L'existence de cet état VNC chez Brettanomyces peut également engendrer des erreurs de détection. Un nouvel outil de détection par hybridation in situ et lecture par cytométrie en flux a donc été mis en place. Cette méthode permet ainsi la mise en évidence des cellules de Brettanomyces présentes en vin de façon efficace et rapide

Etude et caractérisation de l'état " Viable mais Non Cultivable " chez Brettanomyces, une levure d'altération des vins (nouvel outil de détection et de quantification spécifique de Brettanomyces en vin)

L état Viable Non Cultivable (VNC) a été observé et décrit chez de nombreuses espèces bactériennes. Mais cet état métabolique a également été suggéré chez certaines cellules eucaryotes, et notamment chez les levures du vin comme Brettanomyces. L état VNC chez cette levure a donc été étudié afin d en déterminer les conditions d entrée et de sortie, ainsi que les modifications morphologiques et métaboliques associées à cet état VNC. Une addition de sulfite (0,8 mg/L de SO2 moléculaire) induit un état VNC chez Brettanomyces, et une inactivation de ce sulfite par modification du pH du milieu permet une sortie de l état VNC de la levure par un regain de cultivabilité. Dans les conditions VNC, la taille moyenne des cellules de Brettanomyces a été déterminée comme diminuée de 22% comparée à leur taille en condition contrôle. Ensuite, la capacité des cellules à produire des phénols volatils, éléments de contamination des vins, est conservée même lorsque les cellules sont en état Viable Non Cultivable. De plus, l étude comparative des protéomes entre cellules de Brettanomyces témoin et cellules en état VNC montre une modification du métabolisme avec une diminution de la synthèse d ATP compensée par une augmentation des protéines impliquées dans d autres voies métaboliques de production d énergie. Cette étude met donc en évidence pour la première fois l existence de l état VNC chez une espèce eucaryote et montre des points communs avec l état VNC chez les cellules procaryotes. L existence de cet état VNC chez Brettanomyces peut également engendrer des erreurs de détection. Un nouvel outil de détection par hybridation in situ et lecture par cytométrie en flux a donc été mis en place. Cette méthode permet ainsi la mise en évidence des cellules de Brettanomyces présentes en vin de façon efficace et rapide.The viable but not culturable (VBNC) state has been studied in detail in bacteria. It has been suggested that the VBNC state also exists in eukaryote cells, such as wine yeasts, including Brettanomyces in particular. We investigated the VBNC state in this yeast, focusing on the conditions for entry and exit, and the morphological and metabolic modifications associated with this state. We added sulfite (0.8 mg.L-1 molecular SO2) to induce the VBNC state. Increasing the pH of the medium inactivated the sulfite, allowing the cells to exit from the VBNC state and to become culturable again. In these conditions, we found that Brettanomyces VBNC cells were smaller than culturable cells, and that spoilage by volatile phenols could persist during VBNC state. Furthermore, according to our proteome comparison, it seems that the blockade of ATP synthesis was compensated by an increase in energy-producing metabolism pathway. This study provides the first insight into the VBNC state in eukaryote cells, showing common trend to the VBNC state of prokaryotic cells. The existence of VBNC state in Brettanomyces cells can also provoke errors of detection. A new tool of detection by fluorescence in situ hybridization and reading by flow cyometry was thus set up. This method allows the revealing of Brettanomyces cells presence in wine in an efficient and fast way.DIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

Specific Identification and Quantification of the Spoilage Microorganism Brettanomyces in Wine by Flow Cytometry: A Useful Tool for Winemakers

International audienceno abstrac

Characterization of the "viable but nonculturable" (VBNC) state in the wine spoilage yeast [i]Brettanomyces

Although the viable but not culturable (VBNC) state has been studied in detail in bacteria, it has been suggested that maintenance of viability with loss of culturability also exists in eukaryotic cells, such as in the wine spoilage yeast Brettanomyces. To provide conclusive evidence for the existence of a VBNC state in this yeast, we investigated its capacity to become viable and nonculturable after sulfite stress, and its ability to recover culturability after stressor removal. Sulfite addition induced loss of culturability but maintenance of viability. Increasing the medium pH to decrease the concentration of toxic SO2 allowed yeast cells to become culturable again, thus demonstrating the occurrence of a VBNC state in Brettanomyces upon SO2 exposure. Relative to culturable Brettanomyces, VBNC yeast cells were found to display a 22% decrease in size on the basis of laser granulometry. Assays for 4-ethylguaiacol and 4-ethylphenol, volatile phenols produced by Brettanomyces, indicated that spoilage compound production could persist in VBNC cells. These morphological and physiological changes in VBNC Brettanomyces were coupled to extensive protein pattern modifications, as inferred by comparative two-dimensional electrophoresis and mass spectrometric analyses. Upon identification of 53 proteins out of the 168 spots whose abundance was significantly modified in treated cells relative to control, we propose that the SO2-induced VBNC state in Brettanomyces is characterized by a reduced glycolytic flux coupled to changes in redox homeostatis/protein turnover-related processes. This study points out the existence of common mechanisms between yeast and bacteria upon entry to the VBNC state

Evaluation of three Brettanomyces qPCR commercial kits: results from an interlaboratory study

Aim: Brettanomyces bruxellensis is well adapted to high ethanol concentrations and low pH which allows it to develop in difficult environments, such as wine. B. bruxellensis is mainly found in red wine and is regarded as a spoilage yeast due to its production of ethylphenols and other compounds responsible for organoleptic defects. The detection and quantification of this yeast is essential to preventing wine spoilage. Several specific detection and quantification kits based on real time quantitative PCR (qPCR) are commercially available. Although these kits are frequently used by private enological and research laboratories, no scientific reports on the reliability and performance of these kits, including interlaboratory and interassay comparisons, have been published. The aim of this work was to compare commercially available kits for the quantification of B. bruxellensis in red wine to classical method (plate counting on selective medium) in an interlaboratory study. Methods and results: Three different commercial kits were tested on three different wines from Bordeaux, Cotes du Rhone, and Burgundy inoculated with B. bruxellensis at four different concentrations. Five naturally contaminated wines from different French wine regions were also tested. Our results suggest that all the kits tested probably over or underestimate the quantity of B. bruxellensis in red wine and, under specific conditions, give false positives. Conclusion: Quantification may be very heterogeneous depending on the wine, laboratory, or population level. Underestimations or false negative results may have serious consequences for winemakers. Overestimation may be partly due to the quantification of dead cells by qPCR. Significance and impact of the study: This study highlights that quantification of B. bruxellensis in red wine using commercial kits requires a high level of expertise in molecular biology. We recommend that all users use a microbiological internal control to validate DNA extraction yield

Quantification des Brettanomyces par qPCR : Étude de la fiabilité, répétabilité et reproductibilité des kits

Article de revue professionnelleBrettanomyces bruxellensis est une levure d’altération du vin avec de faibles besoins nutritionnels, résistante à l’éthanol et aux faibles pH, lui permettant une implantation en vin durant ou après la fermentation alcoolique (Conterno et al., 2006). B. bruxellensis est capable de produire des phénols volatils (éthyl-4-phénol, éthyl-4-gaïacol et éthyl-4-catéchol) (Oelofse et al., 2008). Ces molécules volatiles odorantes amènent un caractère phénolé et animal au vin connu sous le nom de « caractère Brett ». D’autres molécules (2-acétyltétrahydropyridine et 2-éthyltétrahydropyridine) produites par B. bruxellensis sont également responsables d’une déviation organoleptique appelée communément « goût de souris ». La détection et la quantification de cette levure sont donc nécessaires afin d’éviter l’altération du vin. L’isolement de cette levure sur milieu gélosé est utilisé en routine par les laboratoires spécialisés en œnologie. Cette méthode nécessite un temps d’incubation très long (> 7 jours) mais ne permet pas la quantification des cellules viables non cultivables. Des cultures en milieu liquide contenant les précurseurs des phénols volatils sont parfois effectuées afin de déterminer si les vins testés contiennent ou non B. bruxellensis. L’apparition de l’odeur « Brett » plus ou moins rapide permet d’avoir une estimation sur la quantité de cellules présentes. La cytométrie en flux est également un outil utilisé par les laboratoires afin de quantifier de manière spécifique B. bruxellensis : sonde spécifique fluorescente (Serpaggi et al., 2010), anticorps. En France comme à l’étranger, la principale méthode moléculaire utilisée est la PCR quantitative (qPCR). De nombreuses études portant sur cette dernière ont permis le développement de kits commerciaux afin de dénombrer spécifiquement B. bruxellensis dans le vin. Cependant, aucune étude n’a été effectuée sur la fiabilité, la répétabilité et la reproductibilité de ces kits. C’est pourquoi, dans cette étude, nous avons comparé les résultats obtenus en utilisant trois kits qPCR commerciaux permettant d’extraire l’ADN des cellules et de quantifier B. bruxellensis en vin rouge. Les analyses ont été effectuées par trois laboratoires sélectionnés, spécialisés en analyses œnologiques et sur trois vins rouges élaborés dans 3 régions différentes

Quantification des Brettanomyces par qPCR

International audienceBrettanomyces bruxellensis est une levure d’altération du vin avec de faibles besoins nutritionnels, résistante à l’éthanol et aux faibles pH, lui permettant une implantation en vin durant ou après la fermentation alcoolique (Conterno et al., 2006). B. bruxellensis est capable de produire des phénols volatils (éthyl-4-phénol, éthyl-4-gaïacol et éthyl-4-catéchol) (Oelofse et al., 2008). Ces molécules volatiles odorantes amènent un caractère phénolé et animal au vin connu sous le nom de « caractère Brett ». D’autres molécules (2-acétyltétrahydropyridine et 2-éthyltétrahydropyridine) produites par B. bruxellensis sont également responsables d’une déviation organoleptique appelée communément « goût de souris ».La détection et la quantification de cette levure sont donc nécessaires afin d’éviter l’altération du vin. L’isolement de cette levure sur milieu gélosé est utilisé en routine par les laboratoires spécialisés en œnologie. Cette méthode nécessite un temps d’incubation très long (> 7 jours) mais ne permet pas la quantification des cellules viables non cultivables. Des cultures en milieu liquide contenant les précurseurs des phénols volatils sont parfois effectuées afin de déterminer si les vins testés contiennent ou non B. bruxellensis. L’apparition de l’odeur « Brett » plus ou moins rapide permet d’avoir une estimation sur la quantité de cellules présentes. La cytométrie en flux est également un outil utilisé par les laboratoires afin de quantifier de manière spécifique B. bruxellensis : sonde spécifique fluorescente (Serpaggi et al., 2010), anticorps. En France comme à l’étranger, la principale méthode moléculaire utilisée est la PCR quantitative (qPCR). De nombreuses études portant sur cette dernière ont permis le développement de kits commerciaux afin de dénombrer spécifiquement B. bruxellensis dans le vin. Cependant, aucune étude n’a été effectuée sur la fiabilité, la répétabilité et la reproductibilité de ces kits.C’est pourquoi, dans cette étude, nous avons comparé les résultats obtenus en utilisant trois kits qPCR commerciaux permettant d’extraire l’ADN des cellules et de quantifier B. bruxellensis en vin rouge. Les analyses ont été effectuées par trois laboratoires sélectionnés, spécialisés en analyses œnologiques et sur trois vins rouges élaborés dans 3 régions différentes

Partial vinylphenol reductase purification and characterization from Brettanomyces bruxellensis

International audienceBrettanomyces is the major microbial cause for wine spoilage worldwide and causes significant economic losses. The reasons are the production of ethylphenols that lead to an unpleasant taint described as 'phenolic odour'. Despite its economic importance, Brettanomyces has remained poorly studied at the metabolic level. The origin of the ethylphenol results from the conversion of vinylphenols in ethylphenol by Brettanomyces hydroxycinnamate decarboxylase. However, no information is available on the vinylphenol reductase responsible for the conversion of vinylphenols in ethylphenols. In this study, a vinylphenol reductase was partially purified from Brettanomyces bruxellensis that was active towards 4-vinylguaiacol and 4-vinylphenol only among the substrates tested. First, a vinylphenol reductase activity assay was designed that allowed us to show that the enzyme was NADH dependent. The vinylphenol reductase was purified 152-fold with a recovery yield of 1.77%. The apparent K(m) and V(max) values for the hydrolysis of 4-vinylguaiacol were, respectively, 0.14 mM and 1900 U mg(-1). The optimal pH and temperature for vinylphenol reductase were pH 5-6 and 30 degrees C, respectively. The molecular weight of the enzyme was 26 kDa. Trypsic digest of the protein was performed and the peptides were sequenced, which allowed us to identify in Brettanomyces genome an ORF coding for a 210 amino acid protein

Diversité des Brettanomyces et de leur résistance au SO2. Les nouvelles avancées vers une meilleure gestion du SO2 en vinification.

Article de revue professionnelleDes recherches ont été menées par le Groupe National « Lutte contre Brettanomyces » et plus particulièrement sur la relation SO2 et Brettanomyces bruxellensis afin d’approfondir les connaissances sur le comportement de la levure et d’apporter des données essentielles à une bonne gestion du risque. Une grande diversité de la levure Brettanomyces a été mise en évidence (identification de différents groupes génétiques) ainsi que des comportements différents vis-à-vis du SO2 : sensibles, tolérants ou résistant. Grâce à la mise au point d’un outil prédictif (TYP \ Brett), les professionnels pourront connaître le groupe génétique pour mieux intervenir. Ces travaux ont également mis en évidence la nécessité d’adapter la dose de SO2 actif en fonction du niveau de population de B. bruxellensis, mais également l’importance d’avoir des méthodes de détection estimant les niveaux de contamination réels de population viable en s’affranchissant des faux positifs (levures mortes ou viables non-cultivables). Un outil d’aide à la décision, le modèle Brett permettra de prédire le risque de développement de B. bruxellensis et la production de phénols en fonction des paramètres œnologiques du vin notamment la dose de SO2 actif. Il sera d’une grande utilité aux vignerons dans la lutte du risque Brettanomyces