Etude et caractérisation de l'état " Viable mais Non Cultivable " chez Brettanomyces, une levure d'altération des vins (nouvel outil de détection et de quantification spécifique de Brettanomyces en vin)

Abstract

L état Viable Non Cultivable (VNC) a été observé et décrit chez de nombreuses espèces bactériennes. Mais cet état métabolique a également été suggéré chez certaines cellules eucaryotes, et notamment chez les levures du vin comme Brettanomyces. L état VNC chez cette levure a donc été étudié afin d en déterminer les conditions d entrée et de sortie, ainsi que les modifications morphologiques et métaboliques associées à cet état VNC. Une addition de sulfite (0,8 mg/L de SO2 moléculaire) induit un état VNC chez Brettanomyces, et une inactivation de ce sulfite par modification du pH du milieu permet une sortie de l état VNC de la levure par un regain de cultivabilité. Dans les conditions VNC, la taille moyenne des cellules de Brettanomyces a été déterminée comme diminuée de 22% comparée à leur taille en condition contrôle. Ensuite, la capacité des cellules à produire des phénols volatils, éléments de contamination des vins, est conservée même lorsque les cellules sont en état Viable Non Cultivable. De plus, l étude comparative des protéomes entre cellules de Brettanomyces témoin et cellules en état VNC montre une modification du métabolisme avec une diminution de la synthèse d ATP compensée par une augmentation des protéines impliquées dans d autres voies métaboliques de production d énergie. Cette étude met donc en évidence pour la première fois l existence de l état VNC chez une espèce eucaryote et montre des points communs avec l état VNC chez les cellules procaryotes. L existence de cet état VNC chez Brettanomyces peut également engendrer des erreurs de détection. Un nouvel outil de détection par hybridation in situ et lecture par cytométrie en flux a donc été mis en place. Cette méthode permet ainsi la mise en évidence des cellules de Brettanomyces présentes en vin de façon efficace et rapide.The viable but not culturable (VBNC) state has been studied in detail in bacteria. It has been suggested that the VBNC state also exists in eukaryote cells, such as wine yeasts, including Brettanomyces in particular. We investigated the VBNC state in this yeast, focusing on the conditions for entry and exit, and the morphological and metabolic modifications associated with this state. We added sulfite (0.8 mg.L-1 molecular SO2) to induce the VBNC state. Increasing the pH of the medium inactivated the sulfite, allowing the cells to exit from the VBNC state and to become culturable again. In these conditions, we found that Brettanomyces VBNC cells were smaller than culturable cells, and that spoilage by volatile phenols could persist during VBNC state. Furthermore, according to our proteome comparison, it seems that the blockade of ATP synthesis was compensated by an increase in energy-producing metabolism pathway. This study provides the first insight into the VBNC state in eukaryote cells, showing common trend to the VBNC state of prokaryotic cells. The existence of VBNC state in Brettanomyces cells can also provoke errors of detection. A new tool of detection by fluorescence in situ hybridization and reading by flow cyometry was thus set up. This method allows the revealing of Brettanomyces cells presence in wine in an efficient and fast way.DIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF