Comparative Genome Analysis Provides Insights into the Pathogenicity of Flavobacterium psychrophilum

Artículo de publicación ISIFlavobacterium psychrophilum is a fish pathogen in salmonid aquaculture worldwide that causes cold water disease (CWD) and rainbow trout fry syndrome (RTFS). Comparative genome analyses of 11 F. psychrophilum isolates representing temporally and geographically distant populations were used to describe the F. psychrophilum pan-genome and to examine virulence factors, prophages, CRISPR arrays, and genomic islands present in the genomes. Analysis of the genomic DNA sequences were complemented with selected phenotypic characteristics of the strains. The pan genome analysis showed that F. psychrophilum could hold at least 3373 genes, while the core genome contained 1743 genes. On average, 67 new genes were detected for every new genome added to the analysis, indicating that F. psychrophilum possesses an open pan genome. The putative virulence factors were equally distributed among isolates, independent of geographic location, year of isolation and source of isolates. Only one prophage-related sequence was found which corresponded to the previously described prophage 6H, and appeared in 5 out of 11 isolates. CRISPR array analysis revealed two different loci with dissimilar spacer content, which only matched one sequence in the database, the temperate bacteriophage 6H. Genomic Islands (GIs) were identified in F. psychrophilum isolates 950106-1/1 and CSF 259-93, associated with toxins and antibiotic resistance. Finally, phenotypic characterization revealed a high degree of similarity among the strains with respect to biofilm formation and secretion of extracellular enzymes. Global scale dispersion of virulence factors in the genomes and the abilities for biofilm formation, hemolytic activity and secretion of extracellular enzymes among the strains suggested that F. psychrophilum isolates have a similar mode of action on adhesion, colonization and destruction of fish tissues across large spatial and temporal scales of occurrence. Overall, the genomic characterization and phenotypic properties may provide new insights to the mechanisms of pathogenicity in F. psychrophilum.Danish Directorate for Food, Fisheries and Agri Business 3414-09-02613 Danish Strategic Research Council (ProAqua) 09-072829 EU-IRSES (AQUAPHAGE) 69175 EU-IRSE

Diferencias en la expresión de genes de Vibrio parahaemolyticus crecido en condiciones ambientales y de aislamiento clínico

109 p.Vibrio parahaemolyticus es una bacteria gram negativa que habita en océanos formando parte de la flora bacteriana de moluscos bivalvos o bien de forma libre en el agua. Algunas de las bacterias de esta especie infectan humanos por medio del consumo de alimentos poco cocidos o crudos, produciendo una gastroenteritis aguda a nivel intestinal. Pese a que su origen es antiguo, los estudios de esta bacteria comenzaron en mayor medida en 1996, cuando surge un serotipo con características pandémicas (O3:K6), correspondiente a un grupo clonal especifico , infectando a un gran número de personas en Asia, Europa, África, América del Norte y América del Sur. En Chile en el año 2005 produjo un brote con aproximadamente 10.000 casos. Las características de V. parahaemolyticus le permiten adaptarse a diferentes condiciones ambientales. La mayoría de las cepas conocidas puede crecer a una temperatura de 37°C, pH ácido, y sales biliares, condiciones que se usan para su aislamiento y diagnóstico en el laboratorio. Las características de patogenicidad de la bacteria están relacionadas a los factores de virulencia que puede expresar, entre estos, existen sistemas de secreción específicos, pueden secretar diferentes sustancias dañinas o toxicas en el medio donde habitan.En este proyecto se propuso realizar un análisis de expresión diferencial, para comprender los cambios de V. parahaemolyticus en sus etapas de crecimiento cuando vive en 2 condiciones diferentes simuladas en laboratorio, las cuales abarcan la condición ambiental de la bacteria en los océanos (LB a 12 oC con 3% NaCl), y la condición de aislamiento en laboratorio (LB a 37°C con 0.9% NaCl con sales biliares 0.04 %).Las muestras abarcan tres replicas biológicas para cada condición, y fueron obtenidas a partir de secuenciación de alto rendimiento de RNA. El análisis estuvo enfocado a estudiar el transcriptoma de V. parahaemolyticus e identificar los genes que aumentan o disminuyen su expresión en ambas condiciones, para ello, se utilizaron herramientas de software computacional bioinformáticos capaces de trabajar con las lecturas de RNA obtenidas por el secuenciador; con ellas se calculó la expresión diferencial de los genes. Los resultados obtenidos muestran que en las condiciones de aislamiento se expresaron diferencialmente 767 genes de los 4991 genes anotados, 337 (6,75 %) aumentados y 430 disminuidos (8,62 %). 449 genes son del cromosoma I y 318 del cromosoma II, similar a la relación de sus tamaños. Entre los 50 genes con mayor expresión, la proteína ornitina decarboxilasa (VPA1635) encargada de la síntesis de putrescina, aumentó su expresión aproximadamente 328 veces,por otro lado, la proteína co-regulada por hemolisina (Hcp1) secretada por T6SS1, disminuyo su expresión aproximadamente 142 veces.Entre los 10 genes con mayor expresión diferencial se identifica un grupo genes vecinos que codifican proteínas relacionadas con la respiración celular, aumentaron su expresión aproximadamente 45 veces. Entre los sistemas de secreción estudiados, T3SS1 presentaba en su mayoría una expresión disminuida, a diferencia de T3SS2 que presentaba una expresión aumentada. T6SS1 y T6SS2 presentaban en su mayoría una expresión disminuida.Las categorías de Gene Ontology sobre representadas de mayor interés en expresión aumentada fueron relacionadas a transporte y localización, mientras que en expresión disminuida fueron relacionadas a patogénesis y secreción./ ABSTRACT: Vibrio parahaemolyticus is a gram negative bacterium that inhabits oceans freely in seawater or associated with higher organisms, specially. Some bacteria of this species can infect humans when they ingest undercooked or raw seafood, producing an intestinal gastroenteritis. Although its origin is ancient, the studies of this bacterium began to a greater extent in 1996, when a serotype with pandemic characteristics (O3: K6), corresponding to a speci c clonal group emerge, infecting a large number of people in Asia, Europe, Africa, North America and South America. In Chile in 2005, it produced an outbreak with approximately 10,000 cases. V. parahaemolyticus may adapt to di erent conditions. Most of the known strains can grow at 37^A C of temperature, acid pH, and bile salts, conditions that are used for isolation and diagnosis in the laboratory. The pathogenicity properties of the bacteria are related to the virulence factors such as speci c secretion systems that can secrete diferent harmful or toxic substances. In this project it was proposed to perform a di erential expression analysis to understand the changes of V. parahaemolyticus in its growth stages when it lives in 2 diferent simulated laboratory conditions, which cover the environmental condition of the bacterium in the oceans (LB, 12°C, 3% NaCl), and the condition Isolated in laboratory (LB, 37°C, 0.9% NaCl with bile salt 0.04%). The samples were composed of three biological replicates for each condition, and were obtained from high throughput RNA sequencing. The analysis was focused on studying the V. parahaemolyticus transcriptome and identifying the upregulated and downregulated genes, using bioinformatics computational software tools able to work with the RNA reads obtained by the sequencer; With them the di erential expression of the genes was calculated. The results show that in the isolation conditions, 767 genes were di erentially expressed from the 4991 genes annotated, 337 (6.75%) upregulated and 430 downregulated (8.62%). 449 genes are on chromosome I and 318 on chromosome II, similar to the ratio of their sizes. Between the 50 more highly expressed genes, the ornithine decarboxylase protein (VPA1635) performs the synthesis of putrescine, was about 328 times up regulated, instead, the protein co-regulated by hemolysin (Hcp1) secreted by T6SS1, was about 142 times down regulated.Between the 10 more highest di erential expression genes, were found among neighboring genes coding for proteins related with respiration, about 45 times up regulated. Between the Secretion systems, T3SS1 had a down regulated expression, unlike T3SS2 which had an up regulated. T6SS1 and T6SS2 had mostly down regulated. Gene Ontology categories most signi cantly overrepresented up regulated processes were those related to transport and localization while secretion and pathogenesis related genes were overrepresented among down regulated gene

Complete genome sequence of <i>Vibrio anguillarum</i> phage CHOED successfully used for phage therapy in aquaculture

Vibrio anguillarum phage CHOED was isolated from Chilean mussels. It is a virulent phage showing effective inhibition of V. anguillarum. CHOED has potential in phage therapy, because it can protect fish from vibriosis in fish farms. Here, we announce the completely sequenced genome of V. anguillarum phage CHOED

Estudio comparativo de variaciones en las secuencias de regiones CRISPRs y huellas de fagos en cepas de Vibrio parahaemolyticus

68 p.Estudios recientes de los genomas bacterianos han revelado diferentes componentes asociados a genomas de virus bacterianos o bacteriófagos, en la forma de fragmentos aislados, secuencias de profagos no funcionales o fagos crípticos, y también secuencias llamadas CRISPRs que le confieren inmunidad a la bacteria frente a virus y plásmidos. Todos estos elementos constituyen un registro de diferentes huellas de fagos y proporcionan una oportunidad de determinar la historia de infecciones, y sus posibles efectos en la evolución de bacterias a través de su caracterización y estudio comparativo. Acorde a los antecedentes mencionados, en el presente estudio se realizó la identificación de elementos relacionados con bacteriófagos, específicamente, secuencias CRISPR y huellas de fagos, en 8 cepas pandémicas serotipo O3:K6 de Vibrio parahaemolyticus, aisladas en Chile, cercanamente relacionadas. Una vez identificados los CRISPR para cada una de las cepas, se compararon de manera de determinar diferencias entre cepas. Este análisis no mostro diferencias entre las cepas chilenas. Después de esta observación se decidió extender el estudio a cepas de V. parahaemolyticus pandémico que pudieran tener un mayor tiempo de evolución independiente, y así mayores oportunidades de infección por fagos, como las cepas AN5030, K5034 y Peru466 encontradas en otros sitios del planeta. Además se incluyó una cepa no pandémica, filogenéticamente mucho más distantes, AQ3810. Los resultados mostraron solo la presencia de un SNV (Variante de un simple nucleótido)en esta última cepa. Lo cual sugiere que el sistema CRISPR-Cas no está actuando como un mecanismo que le confiera inmunidad a estas bacterias frente a virus y plásmidos

Diferencia en la composición de small RNAs en Vibrio parahaemolyticus que crecen en condiciones ambientales y de aislamiento

108 p.El marisco puede ser un medio de transmisión de bacterias por medio de alimentos infectados causando enfermedades en seres humanos en todo el mundo. Las bacterias del genero Vibrio son responsables de grandes brotes de origen alimentario a nivel mundial, en especial V. parahaemolyticus el cual es reconocido como un patógeno transmitido por los alimentos, en donde continuamente nuevas cepas patógenas causan diversos casos de enfermedades gastrointestinales en el ser humano. V. parahaemolyticus detecta diversos cambios en el ambiente y desencadena una cascada de respuestas a nivel transcripcional y de regulación génica, además de ser una especie microbiana autóctona marina que comprende cepas bacterianas capaces de crecer en un cultivo que contiene sales biliares a 37 C, una condición raramente encontrada en el océano, pero utilizada para aislamiento en el laboratorio. En 1996 en Calcuta, India, se produjo un brote importante donde el 80% de estas enfermedades eran causadas por el serotipo O3:K6 perteneciente a un grupo clonal nuevo. Este grupo de este serotipo ocasiono una pandemia que afecto a decenas de miles de personas en Asia, Europa, África, América del norte y América del Sur. En el año 2005 un brote se expandió por todo Chile llegando a causar mas de 10.000 casos clínicos. La regulación de los genes puede ser estudiada analizando el RNA mensajero y los small RNA que participan en la regulación de los primeros. Los small RNA (sRNA) son una clase de RNA no codificante (nc-RNA), y tienen un papel relevante como reguladores, dada la cascada de señales regulatorias que provocan. Existen ncRNA que tienen una función estructural, mientras que otros tienen una función regulatoria, pudiendo regular uno o más genes que actúan en diferentes vías metabólicas de las bacterias. Por lo cual surge la pregunta, ¿Que sRNA se estarían expresando diferencialmente al pasar de una condición semejante a la ambiental a la utilizada para el aislamiento de las cepas patógenas que se practica en el laboratorio? Para estudiar la expresión génica se comparó la expresión de V. parahaemolyticus cuando se cultiva a 37°C|, 0,9% de NaCl y 0,04% de sales biliares con la de 12°C, 3% de NaCl sin sal biliar mediante secuenciación de alto rendimiento del RNA obtenido a partir de muestras triplicadas en ambas condiciones. Nuestros resultados mostraron que entre los 43 small RNA anotados señalados en la base de datos BSRD para V. parahaemolyticus, 6 aumentaron y 3 disminuyeron su expresión. Entre ellos, los tres reguladores de almacenamiento de carbono B (CsrB), el 6S RNA, Purina y Lisina riboswitch aumentaron de 3 a 5 veces, en cambio, RyhB, relacionado con el metabolismo del Fe además del control de la motilidad, el Spot 42 y TPP riboswitch descendieron de 3 a 9 veces./ ABSTRACT: Seafood can be a mode of transmission of bacteria through infected food causing illness in humans worldwide. Bacterial of the genus Vibrio are responsible for large foodborne outbreaks worldwide, especially, V. parahaemolyticus is recognized as a foodborne pathogen, where continuously new pathogenic strains emerge causing large outbreaks of gastrointestinal illness in humans. V. parahaemolyticus triggers a cascade of responses to transcriptional levels and gene regulation when growth conditions are changed. It is an autochthonous microbial species comprising bacterial strains capable of growing in a culture containing bile salts at 37 C, a condition rarely found in the ocean but used for isolation in the laboratory. In 1996 in Calcutta, India, there was a major outbreak where 80% of these diseases were caused by serotype O3: K6 belonging to a new clonal group. This new clonal group caused a pandemic that a ected tens of thousands of people in Asia, Europe, Africa, North America and South America. In 2005 an outbreak spread throughout Chile causing more than 10.000 clinical cases. The regulation of the genes can be studied by analyzing the messenger RNA and the small RNA involved in the regulation of the rst. The sRNA are a class of non-coding RNA (nc-RNA), and have an important role as regulators, given the cascade of regulatory signals. There are ncRNA having a structural function, while others have a regulatory function, can regulate one or more genes acting on diferent metabolic pathways of bacteria. Our question was, what sRNA would be diferentially expressed in conditions used for the isolation of pathogenic strains in the laboratory referred to those more similar to its natural environment?. To study this di erential gene expression, the expression of V. parahaemolyticus was compared when cultured at 37 C, 0,9% NaCl and 0,04% bile salts to those when growing at 12 C, 3% NaCl without bile salt by high throughput sequencing of RNA obtained from triplicate samples of bacteria growing under each condition. Our results showed that among the 43 small RNA annotated in the BSRD database for V. parahaemolyticus, 6 increased and 3 decreased their expression. Among them, the three carbon storage regulators B genes (CsrB), 6S RNA, Purine and Lysine riboswitch increased between 3 to 5 times, whereas that of RyhB, related to the metabolism of Fe in addition to the control of motility, Spot 42 and TPP riboswitch decreased its expression between 3 to 9 times

Estudio de secuencias 5k en Vibrio parahaemolyticus y análisis de la microevolución de esta bacteria en las costas chilenas

79 p.Vibrio parahaemolyticus es una bacteria marina asociada a enfermedades gastrointestinales en humanos. En Chile, una población clonal de esta especie (clon pandémico) causó un brote de diarrea, con más de 10.000 casos sólo el verano del 2005. Estudios realizados en el Centro Nacional de Genómica y Bioinformática han descubierto que algunas cepas chilenas de V. parahaemolyticus poseen una secuencia de 5600 bp, denominada 5k, que no está presente en el genoma de referencia para esta población clonal. En las cepas chilenas, anterior a la región 5k, existe otra región de aproximadamente 5000 bp, llamada 5k’, que sí está en el genoma de referencia. Dentro de la región que comprende 5k y 5k’ existen 3 regiones repetidas, una en cada extremo y una tercera que separa 5k de 5k’. Se ha observado que en la región 5kk’ hay segmentos que presentan similitud con profagos crípticos y algunas proteínas putativas que podrían jugar un rol en la virulencia. Este estudio tiene como objetivo determinar cuál es la implicancia de las secuencias 5k y 5k’, además de estudiar la microevolución de V. parahaemolyticus en las costas chilenas, para así poder entender mejor su comportamiento durante estos años. La metodología será un análisis in sillico, con programas como BLAST, CLC, CELERA, SMALT, MAUVE, Bioperl, etc. Se espera corroborar que las secuencias 5k y 5k’ se originaron a partir de elementos móviles, posiblemente adquiridos por transferencia horizontal./ABSTRACT: Vibrio parahaemolyticus is a marine bacteria associated with gastrointestinal diseases in humans. In Chile, a clonal population of this bacteria (pandemic clon) caused a diarrhea infection with more than 10,000 cases only at the summer on 2005. Studies in “Centro Nacional de Genómica y Bioinformática” have discovered that some chilean strains of V. parahaemolyticus have a sequence of 5600 bp, called 5k, this one isn’t presented in the reference genome of this population. In the chilean strains, previous to 5k region, there is another region of about 5000 bp, called 5k’ which exists in the reference genome. Inside of the region between 5k and 5k’, there are 3 repeat regions, each one in other side and a third one which separate 5k from 5k’. It has observed in the 5k-5k’ region there are segments that show similitudes with cryptic prophages and some putative proteins that could play a role in the virulence. The aims of this study are to determine which is the implication of 5k and 5k’ sequences and to study the microevolution of V. parahaemolyticus at the chilean coast, to understand its behavior during last year’s. The methodology that we are going to use will be an in silico analysis, with softwares like BLAST, CLC, CELERA, SMALT, MAUVE, Bioperl, etc. We hope to check that 5k and 5k’ sequences correspond to mobile elements, possibly acquired by lateral transfer.Therefore, the process of maturation and softening are relevant for breeding purposes, because its texture, aroma and flavor are desired characteristics for consumers. The softening process has been related to the decrease of turgor, because of the loss water, and disassembling of the cell wall, among others reasons. Has been studied that these disassembling is related to enzimes that catalize cellular components like pectins and hemicellulose, these enzimes are polygalacturonase, endo-beta-1,4- glucanase, pectate lyase, pectin methylesterase, XTH, beta-galactosidase, expansin, among others. In this study the promoter of genes that code the enzimes related to softening in strawberry were analyzed, and identified response elements to the fitohormones, abscisic acid, auxin and ethylene and also to the transcription factors MYB, MYC and bHLH in the F.vesca genome and using the suppressive subtractive hybridization library from F. chiloensis. Thus, has been generated new information about the regulation of these genes involved in the cell wall disassembling and softening in strawberry

Amplification of tlh gene in other Vibrionaceae specie by specie-specific multiplex PCR of Vibrio parahaemolyticus

Background: The surveillance of Vibrio parahaemolyticus in the Chilean coast has been mainly performed by multiplex PCR amplification of three different hemolysin genes, which are specie-specific virulence factors. These genes are also employed in the determination of V. parahaemolyticus pathogenic load in seafood and for characterization of pathogenic strains associated to diarrhea cases in human. During environmental surveillance that we performed every summer, we occasionally observed a thermolabile hemolysin (tlh) PCR product of a slightly smaller size than expected, which was coincident with low loads of V. parahaemolyticus in the environment. In order to understand this observation, we probed the specificity of tlh primers for the detection of V. parahaemolyticus at different bacterial loads and DNA concentrations. Results: Primers used for the detection of V. parahaemolyticus specific tlh amplified a slightly smaller tlh gene, which is found in Vibrio alginolyticus and other related strains. These amplicons were observed when V. parahaemolyticus was absent or in undetectable loads in the environment. Conclusions: Surveillance of V. parahaemolyticus using tlh primers can be imprecise because amplification of a V. parahaemolyticus specific marker in V. alginolyticus and other related strains occurs. This situation complicates potentially the estimation of bacterial load in seafood, because do not ensure the correct identification of V. parahaemolyticus when his load is low. Additionally, it could complicate the tracking of outbreaks of V. parahaemolyticus infections, considering the genetic markers used would not be specie-specific