Hongos alcalino-tolerantes como potencial fuente de enzimas de interés biotecnológico

El presente trabajo está relacionado con la etapa inicial del desarrollo de los procesos enzimáticos, es decir el screening de actividades enzimáticas. El objeto de estudio lo constituyen un grupo de hongos filamentosos que fueron aislados por la Dra. Marta Cabello del Instituto Spegazzini (UNLP) de los suelos que constituyen el ecosistema de los bosques de tala (Celtis tala) y coronillo (Scutia buxifolia) situados en la región costera de la Provincia de Buenos Aires (partidos de Magdalena y Punta Indio). En estos suelos con alto porcentaje de carbonato de calcio y pH entre 7.2 y 9.0, habitan especies de la microbiota fúngica con capacidad de crecer en medios altamente alcalinos (pH 9-10). Esta capacidad adaptativa hace suponer que tengan la propiedad de segregar enzimas alcalino-tolerantes o alcalinoactivas, requeridas para la degradación de los sustratos presentes en el suelo. Hasta el momento no se han realizado estudios sobre qué tipo de enzimas producen estos microorganismos. Resultó por lo tanto de interés realizar un screening de actividades enzimáticas alcalinas focalizado principalmente en aquellas enzimas involucradas en la degradación de la pared celular vegetal, en particular las pectinasas, ya que las mismas presentan un potencial interés tecnológico. Para una mejor comprensión del presente trabajo, a continuación se describe la estructura de la pared celular vegetal, las enzimas involucradas en su degradación y sus potenciales aplicaciones tecnológicas. Del mismo modo, se hace referencia a los hongos implicados en el screening enzimático y su cultivo in vitro.Facultad de Ciencias Exacta

Hongos alcalino-tolerantes como potencial fuente de enzimas de interés biotecnológico

El presente trabajo está relacionado con la etapa inicial del desarrollo de los procesos enzimáticos, es decir el screening de actividades enzimáticas. El objeto de estudio lo constituyen un grupo de hongos filamentosos que fueron aislados por la Dra. Marta Cabello del Instituto Spegazzini (UNLP) de los suelos que constituyen el ecosistema de los bosques de tala (Celtis tala) y coronillo (Scutia buxifolia) situados en la región costera de la Provincia de Buenos Aires (partidos de Magdalena y Punta Indio). En estos suelos con alto porcentaje de carbonato de calcio y pH entre 7.2 y 9.0, habitan especies de la microbiota fúngica con capacidad de crecer en medios altamente alcalinos (pH 9-10). Esta capacidad adaptativa hace suponer que tengan la propiedad de segregar enzimas alcalino-tolerantes o alcalinoactivas, requeridas para la degradación de los sustratos presentes en el suelo. Hasta el momento no se han realizado estudios sobre qué tipo de enzimas producen estos microorganismos. Resultó por lo tanto de interés realizar un screening de actividades enzimáticas alcalinas focalizado principalmente en aquellas enzimas involucradas en la degradación de la pared celular vegetal, en particular las pectinasas, ya que las mismas presentan un potencial interés tecnológico. Para una mejor comprensión del presente trabajo, a continuación se describe la estructura de la pared celular vegetal, las enzimas involucradas en su degradación y sus potenciales aplicaciones tecnológicas. Del mismo modo, se hace referencia a los hongos implicados en el screening enzimático y su cultivo in vitro.Facultad de Ciencias Exacta

Enzimas fúngicas extremófilas de aplicación biotecnológica: producción y caracterización de ramnosidasas alcalofílicas de Acremonium murorum y Acrostalagmus luteo-albus y poligalacturonasa acidofílica de Aspergillus kawachii

En la actualidad los procesos enzimáticos han ido reemplazando algunos de los procesos químicos tradicionales, por cuestiones económicas, ecológicas o por especificidad. Sin embargo, muchas de las enzimas disponibles no soportan las condiciones de reacción industriales. Como resultado de esto, los microorganismos extremófilos son una valiosa fuente de nuevas enzimas. En base a lo expuesto, se plantearon los siguientes objetivos: • Realizar un screening de actividades enzimáticas de ocho cepas de hongos alcalino-tolerantes o alcalofílicos aislados localmente, focalizando el mismo en las enzimas que degradan pared celular vegetal. • Estudiar la producción y purificación de las Rhasas producidas por A. luteo-albus y por A. murorum a los efectos de optimizar la cantidad de enzima producida y de esta forma poder contar con suficiente cantidad de proteína para caracterizarlas bioquímicamente. • Determinar la capacidad de las Rhasas en estudio para hidrolizar sustratos naturales en condiciones de alcalinidad. • Desarrollar diferentes estrategias de clonado del gen que codifica para la poligalacturonasa ácida (PG1) de A. kawachii. • Analizar la expresión de PG1 activa en cada caso, y caracterizar la proteína obtenida a los efectos de evaluar su posible aplicación en procesos biotecnológicos. • Estudiar el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae recombinante en un medio de cultivo sintético y su capacidad de producir PG1 recombinante. • Determinar las mejores condiciones de producción de la enzima recombinante en sistemas batch y batch alimentado. • Purificar y caracterizar la proteína obtenida respecto de las características de la enzima silvestre.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).Facultad de Ciencias Exacta

Purification and characterization of a polygalacturonase produced by Wickerhamomyces anomalus

The aim of this work was to study the purification and physicochemical properties of an endo-polygalacturonase (PG) produced by Wickerhamomyces anomalus isolated from the citrus fruit peels. The enzyme was purified to homogeneity from the culture filtrate of W. anomalus grown on the yeast nitrogen base medium with glucose as carbon and energy source and citrus pectin as inductor. After anion-exchange chromatography and gel filtration chromatography, PG activity was eluted as a single peak, yielding 21% of the original activity. After dialysis and cation-exchange chromatography, only one fraction with PG activity was obtained, recovering 56% of initial enzyme activity and 1.3-fold increase in specific activity. The molecular weight of the enzyme was estimated as 43 kDa by the SDS-PAGE. The enzyme exhibited maximal activity at pH 4.2 and was stable over a pH range from 3.5 to 6.0 and up to 49°C for 10 h. The Vmax and Km values with polygalacturonic acid as substrate were 0.26 mmol/L. min and 0.173 mg/mL, respectively. Cations such as Cu+2, Fe+3, Mg+2, Mn+2 and Zn+2 did not show any significant effect on PG activity but K+ and Ca+2 reduced it. The purified PG was able to macerate cassava tissues.Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriale

Purification and characterization of a keratinolytic serine protease from Purpureocillium lilacinum LPS # 876

A keratinolytic serine protease secreted by Purpureocillium lilacinum (formerly Paecilomyces lilacinus) upon culture in a basal medium containing 1% (w/v) hair waste as carbon and nitrogen source was purified and characterized. After purification the keratinase was resolved by SDS-PAGE as a homogeneus protein band of molecular mass 37.0 kDa. The extracellular keratinase of P. lilacinum was characterized by its appreciable stability over a broad pH range (from 4.0 to 9.0), and up to 65 °C, along with its strong inhibition by phenylmethylsulphonyl fluoride among the protease inhibitors tested (98.2% of inhibition), thus suggesting its nature as a serine protease. The enzyme was active and stable in the presence of organic solvents such as dimethylsulfoxide, methanol, and isopropanol; certain surfactants such as Triton X-100, sodium dodecylsulfate, and Tween 85; and bleaching agents such as hydrogen peroxide. These biochemical characteristics suggest the potential use of this enzyme in numerous industrial applications.Fil: Cavello, Ivana Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Centro de Investigación y Desarrollo En Fermentaciones Industriales (i); ArgentinaFil: Hours, Roque Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Centro de Investigación y Desarrollo En Fermentaciones Industriales (i); ArgentinaFil: Rojas, Natalia Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Centro de Investigación y Desarrollo En Fermentaciones Industriales (i); ArgentinaFil: Cavalitto, Sebastian Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico la Plata. Centro de Investigación y Desarrollo En Fermentaciones Industriales (i); Argentin

Purification and characterization of a novel alkaline α-L-rhamnosidase produced by Acrostalagmus luteo albus

Rhamnosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of terminal non reducing L-rhamnose for the bioconversion of natural or synthetic rhamnosides. They are of great significance in the current biotechnological area with applications in food and pharmaceutical industrial processes. In this study we isolated and characterized a novel alkaline rhamnosidase from Acrostalagmus luteo albus, an alkali tolerant soil fungus from Argentina. We also present here an efficient, simple, and inexpensive method for purifying the A. luteo albus rhamnosidase and describe the characteristics of the purified enzyme. In presence of rhamnose as sole carbon source, this fungus produces a rhamnosidase of 109 kDa molecular weight and a pI value of 4.6 determined by SDS-PAGE and analytical isoelectric focusing, respectively. This enzyme was purified to homogeneity by chromatographic and electroforetic techniques. Using p-nitrofenil--L rhamnopiranoside as substrate, the enzyme activity shows pH and temperature optima of 8.0 and 55 ºC, respectively. The enzyme exhibited Michaelis-Menten kinetics with KM and Vmax values of 3.38 mmol.l-1 and 68.5 mmol.l-1.min-1. Divalent cations such as Ca+2, Mg+2, Mn+2, and Co+2 or reducing agents such as -mercaptoethanol and dithiothreitol showed no effect over enzyme activity, whereas this was completely inhibited by Zn+2 at a concentration of 0.2 mM. This enzyme showed the capability to hydrolyze some natural rhamnoglucosides such as hesperidin, naringin and quercitrin under alkaline conditions. On the basis of these results, and mainly due to the high activity of the A. luteo albus rhamnosidase under alkaline conditions, this enzyme should be considered as a potential new biocatalyst for industrial applications.Fil: Rojas, Natalia Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes; ArgentinaFil: Voget, Claudio Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Hours, Roque Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Cavalitto, Sebastian Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; Argentin

Purification and characterization of a keratinolytic serine protease from <i>Purpureocillium lilacinum</i> LPS # 876

A keratinolytic serine protease secreted by Purpureocillium lilacinum (formerly Paecilomyces lilacinus) upon culture in a basal medium containing 1% (w/v) hair waste as carbon and nitrogen source was purified and characterized. After purification the keratinase was resolved by SDS-PAGE as a homogeneus protein band of molecular mass 37.0 kDa. The extracellular keratinase of P. lilacinum was characterized by its appreciable stability over a broad pH range (from 4.0 to 9.0), and up to 65 °C, along with its strong inhibition by phenylmethylsulphonyl fluoride among the protease inhibitors tested (98.2% of inhibition), thus suggesting its nature as a serine protease. The enzyme was active and stable in the presence of organic solvents such as dimethylsulfoxide, methanol, and isopropanol; certain surfactants such as Triton X-100, sodium dodecylsulfate, and Tween 85; and bleaching agents such as hydrogen peroxide. These biochemical characteristics suggest the potential use of this enzyme in numerous industrial applications.Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriale

Optimiranje proizvodnje poligalakturonaze iz Aspergillus kawachii, klonirane u Saccharomyces cerevisiae, u šaržnom i prihranjivanom šaržnom uzgoju

Polygalacturonases (PG; EC 3.2.1.15) catalyze the hydrolysis of pectin and/or pectic acid and are useful for industrial applications such as juice clarification and pectin extraction. Growth and heterologous expression of recombinant Saccharomyces cerevisiae which expresses an acidic PG from Aspergillus kawachii has been studied in batch and fed-batch cultures. Kinetics and stoichiometric parameters of the recombinant yeast were determined in batch cultures in a synthetic medium. In these cultures, the total biomass concentration, protein concentration, and enzyme activity achieved were 2.2 g/L, 10 mg/L, and 3 U/mL, respectively, to give a productivity of 0.06 U/(mL·h). In fed-batch cultures, various strategies for galactose feeding were used: (i) after a glucose growth phase, the addition of a single pulse of galactose which gave a productivity of 0.19 U/(mL·h); (ii) after a glucose growth phase, a double pulse of galactose at the same final concentration was added, resulting in a productivity of 0.21 U/(mL·h); (iii) a simultaneous feeding of glucose and galactose, yielding a productivity of 1.32 U/(mL·h). Based on these results, the simultaneous feeding of glucose and galactose was by far the most suitable strategy for the production of this enzyme. Moreover, some biochemical characteristics of the recombinant enzyme such as a molecular mass of ~60 kDa, an isoelectric point of 3.7 and its ability to hydrolyze polygalacturonic acid at pH=2.5 were determined.Poligalakturonaze (EC 3.2.1.15) kataliziraju hidrolizu pektina i/ili pektinske kiseline i mogu se primijeniti u prehrambenoj industriji, npr. za bistrenje soka ili ekstrakciju pektina. U radu je ispitan rast rekombinantnog kvasca Saccharomyces cerevisiae, te heterologna ekspresija kisele poligalakturonaze iz Aspergillus kawachii u šaržnom i prihranjivanom šaržnom uzgoju. U sintetičkom su mediju šaržnim uzgojem određeni kinetički i stehiometrijski parametri rekombinantnog kvasca. Pritom su dobivene ove vrijednosti: koncentracija ukupne biomase od 2,2 g/L; koncentracija proteina od 10 mg/L; enzimska aktivnost od 3 U/mL i produktivnost od 0,006 U/(mL·h). U prihranjivanom su šaržnom uzgoju primijenjene razne strategije prihranjivanja galaktozom: (i) nakon što kvasac utroši glukozu za rast, jednokratnim dodatkom galaktoze postiže se produktivnost od 0,19 U/(mL·h); (ii) nakon utroška glukoze, dvaput se doda galaktoza u jednakim koncentracijama, pri čemu je produktivnost 0,21 U/(mL·h) i (iii) simultanim prihranjivanjem glukozom i galaktozom dobivena je produktivnost od 1,32 U/(mL·h). Zaključeno je da se najbolji rezultati postižu simultanim prihranjivanjem glukozom i galaktozom. Određene su i biokemijske značajke rekombinantnog enzima: molekularna masa od približno 60 kDa, izoelektrična točka od 3,7 i sposobnost enzima da hidrolizira poligalakturonsku kiselinu pri pH=2,5

Optimization of the Production of a Polygalacturonase from Aspergillus kawachii cloned in Saccharomyces cerevisiae in batch and fed-batch cultures

Polygalacturonases (PG; EC 3.2.1.15) catalyze the hydrolysis of pectin and/or pectic acid and are useful for industrial applications such as juice clarification and pectin extraction. Growth and heterologous expression of recombinant S. cerevisiae which expresses an acidic PG from Aspergillus kawachii was studied in batch and fed batch cultures. Kinetics and stoichiometric parameters of the recombinant yeast were determined in batch cultures in a synthetic medium. In these cultures, the total biomass concentration, protein concentration, and enzyme activity achieved were 2.2 g/l, 10 mg/l, and 3 U/ml, respectively, to give a productivity of 0.06 U/ml.h. In fed batch cultures, various strategies for galactose feeding were used: a) after a glucose growth phase, the addition of a single pulse of galactose which gave a productivity of 0.19 U/ml.h.; b) after a glucose growth phase, a double pulse of galactose at the same final concentration, resulting in a productivity of 0.21 U/ml.h.; c) a simultaneous feeding of glucose and galactose, yielding a productivity of 1.32 U/ml.h. Based on these results, the simultaneous feeding of glucose and galactose was by far the most suitable strategy for the production of this enzyme. Moreover, some biochemical characteristics of the recombinant enzyme such as a MW of ~60 kDa, an isoelectric point of 3.7 and its ability to hydrolyze polygalacturonic acid at pH 2.5 were determined.Fil: Rojas, Natalia Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Ortiz, Gastón Ezequiel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Chesini, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Baruque, Diego Jorge. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Cavalitto, Sebastian Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; Argentin