Desenvolvimento de metodologias analíticas utilizando espectrometria de massas e análise multivariada para aplicação em toxicologia e em documentoscopia forense

A Ciência Forense é uma área multidisciplinar, que usa do conhecimento científico para a investigação de questões penais e cíveis. Dentro de suas mais diversas áreas, a Toxicologia e a Documentoscopia Forense necessitam do auxílio de métodos analíticos, como a cromatografia, a espectrometria de massas e a análise multivariada, para a análise de compostos diversos. Em Toxicologia Forense, novos métodos para a detecção das drogas de abuso anfetamina, metanfetamina, cocaína, cetamina, mitraginina e canabinoides (THC e CBD) foram desenvolvidos utilizando coleta de fluido oral em dispositivos de dried oral fluid spots (DOFS) em papel filtro, seguido de extração líquido-líquido e análise por LC-MS/MS. Enquanto que para cinco drogas de abuso foi realizada a validação de um método quantitativo, para os canabinoides foram encontradas dificuldades na extração do papel filtro, e foi proposto um método qualitativo. Ainda, foi realizada uma revisão bibliográfica a respeito dos métodos quantitativos para a análise de canabinoides em fluido oral. Na área da Documentoscopia Forense, uma nova metodologia não-destrutiva, de baixo custo e de fácil acesso, foi desenvolvida para a diferenciação entre marcas de canetas esferográficas azuis. Esse estudo envolveu a captura de imagens utilizando o aplicativo para celulares Photometrix PRO®, com posterior análise estatística multivariada, utilizando PCA, HCA e PLS-DA. Este método demonstra também a necessidade de que Peritos em Documentoscopia tenham conhecimentos de análise multivariada, para proceder com a correta interpretação dos resultados. Para valorizar o conhecimento das metodologias analíticas na análise de tintas de canetas, foram apresentadas duas revisões bibliográficas. A primeira objetivou a busca sistemática dos métodos analíticos já estudados para a diferenciação e para a datação de tintas de canetas esferográficas azuis e pretas. Foram encontrados diversos métodos cromatográficos, de espectroscopia, de espectrometria de massas e de análise multivariada. A segunda revisão buscou a abordagem dessas metodologias voltada para Peritos Brasileiros. Essa Tese de Doutorado destaca ainda a multidisciplinariedade das Ciências Forenses, bem como a necessidade da formação de recursos humanos adequada na Perícia Brasileira.Forensic Science is a multidisciplinary area, which uses scientific knowledge in judicial questions investigations. Among its many subareas, Forensic Toxicology and Documentoscopy demand the support of analytical methodologies for several different compounds’ evaluation, such as chromatographic methods, mass spectrometry and multivariate analysis. Inside Forensic Toxicology scope, new analytical methods were developed for different drugs of abuse detection (amphetamine, methamphetamine, cocaine, ketamine, mitragynine and cannabinoids THC and CBD), using oral fluid collection applied into dried oral fluid spots (DOFS), followed by liquid-liquid extraction and LC-MS/MS analysis. A quantitative method validation was proposed for all drugs, except for cannabinoids, which have shown difficulties in the filter paper extraction process. Therefore, a qualitative method validation is proposed for THC and CBD detection in DOFS. Considering this, a systematic review was conducted concerning cannabinoids quantitative analysis in oral fluid. In Forensic Documentoscopy, it was developed a new non-destructive methodology, of low-cost and easy access, to differentiate between blue ballpoint pen brands. This study used image capturing with Photometrix PRO®, an app for smartphones, followed by multivariate analysis (PCA, HCA and PLS-DA). This method emphasizes that Documentoscopy Experts need to understand multivariate analysis, so that they can proceed with adequate results interpretation. To highlight the need for analytical methodologies knowledge in pen inks analysis, two literature reviews are presented. The first one aimed to perform a systematic search for studied analytical methods used to differentiate or to date blue and black ballpoint pen inks. Several chromatographic, spectroscopy, mass spectrometry and multivariate analysis methods were found. Thus, the second review aimed to highlight the importance of those methods approaches for Brazilian Experts. Besides the technological advance achieved with new analytical methodologies, this Doctorate Thesis highlights Forensic Science as a multidisciplinary field, also reinforcing the need for adequate human resources in Brazil

Immunochromatography screening devices for cannabinoids in oral fluid sample

Cannabis sativa L. is one of the most consumed drugs in the world and recent studies have associated its use with an increase in the number of traffic accidents in different countries. In many countries, like Brazil, simple and reliable methodologies are still needed for the detection of drugs on site, mainly cannabinoids, considering its prevalence of use and oral fluid (OF) has been proved as an appropriate biological matrix for this purpose. Considering that, this work aims to review previous studies on immunochromatographic devices for on-site detection of cannabinoids in OF, discussing their sensitivity, specificity, cut-offs values and confirmatory methods. This data shows the importance of choosing a screening device and it reinforces the need for its implementation in Brazil. The research was conducted on 5 databases and all original articles, published in the last 10 years, were selected. A total of 32 articles were found, providing data for 17 screening devices of distinct brands. Only 2 screening devices showed satisfactory sensitivity and specificity in the evaluated studies (≥80% and ≥90% respectively). However, it should be considered that the screening devices still have some limitations, such as a higher cut-off than those recommended by international guidelines (cut-off > 2 ng/mL), therefore demonstrating the need for more studies in the area and the importance of confirmatory analysis usually fulfilled by LC-MS/MS, GC-MS/MS or GC-MS. Thus, the screening analyzes should not be evaluated by itself, but in association with confirmatory results and observational traits (behavioral changes), for a better understanding of the traffic scenario

Main compounds and major methods in latent fingermark aging analysis : a short review

Fingermarks are a complex biological matrix with variability factors that change in the same donor, depending on the moment of collection, and in different donors, according to age, sex and routine. Thus, they can still undergo alterations related to the deposition surface, the environment, and the variable that connects all those mentioned: the action of time. In Forensic Science, time is a important variable to situate the crime events. This review proposes a classification in the temporal estimation research of fingermarks, dividing them into Temporal Preservation Analysis (TPA) and Temporal Aging Analysis (TAA). In TPA studies, the components in fingermark residues undergo a few changes over time, tending to stability after a certain period. Those are interesting targets to identify possible exogenous components, such as firearm residues, illegal substances and contaminants related to particularity of forensic cases. In TAA studies, a time estimation related to the fingermarks age can be established. In this case, the time elapsed from its deposition until the forensic processing will vary according to the component classes degradation. Endogenous and exogenous substances that are demonstrably present in one donor and that undergo changes over time will, resulting be demonstrated by a decrease in intensity and/or formation of other substances, and those are good targets for this type of study. The same analysis can have both proposals and the instrumental method available will enable the extraction of information relevant to the sample. The purpose of this study is to demonstrate how important is to identify fingermarks components as evidence beyond the ridge pattern and to list the main instrumental methods used in the analysis of fingermark degradation

APPLICATION OF MULTIVARIATE ANALYSIS ON DIGITAL IMAGES OF CANNABIS SATIVA L EXTRACTS

Cannabis sativa L is one of the most used drugs in the world. Information about the plant’s age and storage can help forensic scientists to identify and to track samples. The ratio between the cannabinoids tetrahydrocannabinol (THC) and cannabinol (CBN) has been related to the degradation of cannabis with time. Thus, this study aimed to test Multivariate Image Analysis (MIA) to evaluate cannabis extracts concerning its colors. Initially, 52 samples of Cannabis sativa L. extracts were analyzed by Gas Chromatography coupled to Flame Ionization Detector (GC/FID) to quantify THC and CBN. Afterwards, the extract samples were photographed and analyzed by two different multivariate analysis tools: ChemoStat®, a free chemometrics software, and PhotoMetrix PRO®, an app for mobile devices. Using exploratory analysis of principal component analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA). It was observed that the more intense the color for an extract, the higher concentration of THC and CBN it has, while the lighter color extracts correspond to samples with no THC. The results suggest to propose a simple method for previous clustering of samples that may precede chromatographic analyzes, assist in chemical profile studies or simply aggregate samples of similar profiles for analyzed together

Caracterização das alterações genéticas em hemofílicos A graves do Rio Grande do Sul

A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica hereditária ligada ao cromossomo X, causada pela atividade reduzida ou ausente do fator VIII da coagulação (FVIII). Essa doença é o resultado de mutações heterogêneas no gene do FVIII. A identificação das mutações patogênicas é importante para o aconselhamento genético e para a avaliação das manifestações clínicas. Embora mais de 700 mutações no gene já tenham sido descritas como responsáveis pela HA grave (nível de FVIII <1%), não existem dados a respeito na população do Rio Grande do Sul. O objetivo desse trabalho é a identificação das alterações genéticas em 48 pacientes hemofílicos graves, de diferentes famílias, com resultado negativo para a presença das inversões nos íntrons 22 e 1. Tais inversões são as mutações mais comumente encontradas (40-50% e 5%, respectivamente) em hemofílicos A graves. Todos os pacientes foram analisados para a presença de grandes deleções por PCR multiplex, utilizando-se 35 pares de primers que abrangem os 26 éxons e as regiões 5’ e 3’UTR do gene. Os pacientes que não apresentaram grandes deleções foram analisados por sequenciamento direto dos exons. As variações nas sequências foram verificadas com os softwares Codon Code Aligner e MEGA5.04, para realizar alinhamentos múltiplos e para analisar a tradução da proteína mutada. O software PolyPhen-2 foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estrutura e a função da proteína; o software SDM foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estabilidade da proteína. Uma figura com a localização das mutações no gene do FVIII foi desenhada com o programa Pymol. Foram encontradas em 70% dos pacientes: uma grande deleção (incluindo os éxons 4, 5 e 6), nove pequenas deleções, cinco pequenas inserções, oito mutações de sentido trocado e seis mutações sem sentido, das quais treze são recorrentes e dezesseis são novas mutações, não descritas no banco de dados online HAMSTeRS. Quarenta e quatro por cento dos indivíduos com mutação encontrada desenvolveram inibidores, sugerindo um maior risco de desenvolvimento de inibidores em pacientes com grandes deleções, mutações sem sentido e pequenas deleções/inserções, quando comparado com pacientes com mutações de troca de sentido. Entre outras mutações de efeito evidente, foram encontradas duas mutações (D542G e S109P) que podem interferir em sítios de ligação ao cálcio, uma mutação (P2205R) que pode ser prejudicial à interação entre o FVIII e o fator de von Willebrand (FvW) e uma mutação (L2297R), que altera a superfície eletrostática da proteína. Esses dados contribuem para o melhor entendimento da funcionalidade e da estrutura do FVIII.Hemophilia A (HA) is an X-linked inherited bleeding disorder caused by reduced or absent clotting factor VIII (FVIII) activity, determined by heterogeneous mutations in the FVIII gene. Identification of these pathogenic mutations is important for genetic counseling and the assessment of clinical manifestations. Although more than 700 mutations of the FVIII gene have been reported as responsible for severe hemophilia (FVIII: C<1%), the corresponding data is currently insufficient for Southern Brazilian populations. The aim of this study was to identify genetic changes in 48 unrelated severe HA patients, who showed negative results for inversions in introns 22 and 1. These inversions are the most common mutations (40-50% and 5%, respectively) in severe HA patients. All patients were screened for gross deletions by multiplex PCR, with 35 pairs of primers for the 26 exons and 5’- and 3’- UTR of the gene. Those without any gross deletion were then analyzed by direct sequencing for all exons. Sequence variation was analyzed with the Codon Code Aligner and the Mega0.4 softwares for multiple alignments and protein translation. PolyPhen-2 was used to predict if the mutations would alter protein’s structure and function; SDM was used to verify if the mutations would alter the protein stability. One image with the location of FVIII mutations was drawn with the Pymol software. In 70% of the patients one gross deletion (including exons 4, 5 and 6), nine small deletions, five small insertions, eight missense and six nonsense mutations were found, of which thirteen were recurrent and sixteen were novel, never reported in the HAMSTeRS database. Forty-four per cent of these mutation carriers developed FVIII inhibitors, suggesting a higher risk of inhibitors development in patients with large deletions, small deletions/insertions, and nonsense mutations than in patients with missense mutations. Among mutations of clear effect, two mutations (D542G and S109P) that may interfere with calcium binding, a mutation that may affect FVIII and von Willebrand factor (FvW) interaction (P2205R), and L2297R, that clearly affects the molecule’s electrostatic surface were found. The results enable us to better understand structural and functional aspects of this protein

Caracterização das alterações genéticas em hemofílicos A graves do Rio Grande do Sul

A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica hereditária ligada ao cromossomo X, causada pela atividade reduzida ou ausente do fator VIII da coagulação (FVIII). Essa doença é o resultado de mutações heterogêneas no gene do FVIII. A identificação das mutações patogênicas é importante para o aconselhamento genético e para a avaliação das manifestações clínicas. Embora mais de 700 mutações no gene já tenham sido descritas como responsáveis pela HA grave (nível de FVIII <1%), não existem dados a respeito na população do Rio Grande do Sul. O objetivo desse trabalho é a identificação das alterações genéticas em 48 pacientes hemofílicos graves, de diferentes famílias, com resultado negativo para a presença das inversões nos íntrons 22 e 1. Tais inversões são as mutações mais comumente encontradas (40-50% e 5%, respectivamente) em hemofílicos A graves. Todos os pacientes foram analisados para a presença de grandes deleções por PCR multiplex, utilizando-se 35 pares de primers que abrangem os 26 éxons e as regiões 5’ e 3’UTR do gene. Os pacientes que não apresentaram grandes deleções foram analisados por sequenciamento direto dos exons. As variações nas sequências foram verificadas com os softwares Codon Code Aligner e MEGA5.04, para realizar alinhamentos múltiplos e para analisar a tradução da proteína mutada. O software PolyPhen-2 foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estrutura e a função da proteína; o software SDM foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estabilidade da proteína. Uma figura com a localização das mutações no gene do FVIII foi desenhada com o programa Pymol. Foram encontradas em 70% dos pacientes: uma grande deleção (incluindo os éxons 4, 5 e 6), nove pequenas deleções, cinco pequenas inserções, oito mutações de sentido trocado e seis mutações sem sentido, das quais treze são recorrentes e dezesseis são novas mutações, não descritas no banco de dados online HAMSTeRS. Quarenta e quatro por cento dos indivíduos com mutação encontrada desenvolveram inibidores, sugerindo um maior risco de desenvolvimento de inibidores em pacientes com grandes deleções, mutações sem sentido e pequenas deleções/inserções, quando comparado com pacientes com mutações de troca de sentido. Entre outras mutações de efeito evidente, foram encontradas duas mutações (D542G e S109P) que podem interferir em sítios de ligação ao cálcio, uma mutação (P2205R) que pode ser prejudicial à interação entre o FVIII e o fator de von Willebrand (FvW) e uma mutação (L2297R), que altera a superfície eletrostática da proteína. Esses dados contribuem para o melhor entendimento da funcionalidade e da estrutura do FVIII.Hemophilia A (HA) is an X-linked inherited bleeding disorder caused by reduced or absent clotting factor VIII (FVIII) activity, determined by heterogeneous mutations in the FVIII gene. Identification of these pathogenic mutations is important for genetic counseling and the assessment of clinical manifestations. Although more than 700 mutations of the FVIII gene have been reported as responsible for severe hemophilia (FVIII: C<1%), the corresponding data is currently insufficient for Southern Brazilian populations. The aim of this study was to identify genetic changes in 48 unrelated severe HA patients, who showed negative results for inversions in introns 22 and 1. These inversions are the most common mutations (40-50% and 5%, respectively) in severe HA patients. All patients were screened for gross deletions by multiplex PCR, with 35 pairs of primers for the 26 exons and 5’- and 3’- UTR of the gene. Those without any gross deletion were then analyzed by direct sequencing for all exons. Sequence variation was analyzed with the Codon Code Aligner and the Mega0.4 softwares for multiple alignments and protein translation. PolyPhen-2 was used to predict if the mutations would alter protein’s structure and function; SDM was used to verify if the mutations would alter the protein stability. One image with the location of FVIII mutations was drawn with the Pymol software. In 70% of the patients one gross deletion (including exons 4, 5 and 6), nine small deletions, five small insertions, eight missense and six nonsense mutations were found, of which thirteen were recurrent and sixteen were novel, never reported in the HAMSTeRS database. Forty-four per cent of these mutation carriers developed FVIII inhibitors, suggesting a higher risk of inhibitors development in patients with large deletions, small deletions/insertions, and nonsense mutations than in patients with missense mutations. Among mutations of clear effect, two mutations (D542G and S109P) that may interfere with calcium binding, a mutation that may affect FVIII and von Willebrand factor (FvW) interaction (P2205R), and L2297R, that clearly affects the molecule’s electrostatic surface were found. The results enable us to better understand structural and functional aspects of this protein