Ocular Pharmacokinetic Effects of Drug Binding to Melanin Pigment and the Vitreous Humor

Diseases of the posterior segment of the eye, such as age-related macular degeneration and diabetic retinopathy, are the leading causes of blindness in the developed world. Drug delivery to the posterior eye tissues, including the retina and choroid, is accomplished by frequent intravitreal injections, which are expensive and burdensome to the health care providers and patients, and may cause harmful side effects. Therefore, sustained and less invasive delivery strategies are vitally needed to improve the treatment. Melanin pigment is found at high concentrations in ocular tissues, and many clinical drugs bind to it. Targeting the pigment to obtain sustained drug action in ocular tissues could be a feasible approach for improving ocular drug therapy. Therefore, this thesis project aimed to study the effects of pigment binding on pharmacokinetics in the eye with in vitro, in vivo and in silico methods. In addition, we investigated drug binding to the vitreous humor, as it may participate in modulating ocular pharmacokinetics and has been studied only scarcely. Melanin is a negatively charged, hydrophobic polymer, and it is expected to bind all basic and lipophilic drugs to some extent. Melanin is located in intracellular melanosomes, which are cell organelles surrounded by a lipid membrane, and are expected to have an acidic intraluminal pH. Due to the location of melanin, cellular and physiological factors act in concert with the binding to the melanin polymer, to impact ocular pharmacokinetics of melanin-binding drugs. We investigated pigment binding and related cellular and physiological factors with seven small molecule drug or drug-like compounds: chloroquine, timolol, nadolol, propranolol, methotrexate, 5(6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (CDCF) and diclofenac. A pH-dependent binding (pH 5.0 vs. 7.4) to isolated porcine ocular melanin was observed, mainly with the acidic compounds that are less negatively charged and bind better at pH 5.0. Therefore, pH plays an important role in drug-melanin binding in the case of acidic drugs, but is less important in the case of basic drugs. The binding parameters, maximum binding capacity and affinity, were reliably calculated with the Sips binding isotherm instead of the commonly used Langmuir isotherms. The Sips isotherm is in line with the heterogeneous nature of the melanin surface to where the drugs bind, and, therefore, is better suitable for parameter analysis. Cellular uptake and intracellular binding in pigmented retinal pigment epithelial cells were shown to correlate with melanin binding, but other factors, such as lipophilicity of the drug, also need to be taken into account. Pharmacokinetic simulations of the retention of drugs in pigmented posterior segment tissues demonstrated that low drug permeability in the plasma and melanosomal membranes and the entrapment of positively charged drugs in the melanosome increases melanin binding related retention in these tissues. In addition, both the intracellular binding experiments with pigmented cells and the pharmacokinetic simulations showed that only a small fraction (~0.01%) of the highest binding drug of this study, chloroquine, is in the free form inside the cells. The free form of the drug elicits the drug action (beneficial or harmful), and it is, therefore, important to differentiate between the free and total drug inside the cells when assessing drug response. Furthermore, we demonstrated the distribution and retention of 123I-chloroquine in the eyes of pigmented but not albino rats after intravenous administration, establishing the use of single photon emission computed tomography/computed tomography imaging in monitoring melanin binding related kinetics in vivo. All in all, in the variety of experiments performed, melanin binding was shown to have a major impact on ocular pharmacokinetics in pigmented tissues. In addition to investigating melanin binding, drug binding to the vitreous humor was studied with a cassette of 35 clinical small molecule drugs. The binding was rather low and vitreal binding was concluded to have only a modest effect on ocular pharmacokinetics. In conclusion, this thesis project generated important information of the extensive pharmacokinetic impact of drug-melanin binding in ocular tissues. In addition, we demonstrated the moderate pharmacokinetic impact of vitreal drug binding, which is not comparable to melanin binding. The computational models developed on melanin binding and its pharmacokinetic implications can be used in drug discovery and development. The in vitro methods can also be implemented to the industry scale drug development process. The results obtained support the feasibility of using melanin targeting to attain sustained action in pigmented ocular tissues, but more research into the approach is needed before it can be employed in practice.Silmän takaosan sairaudet, kuten silmänpohjan ikärappeuma ja diabeettinen retinopatia, ovat yleisimpiä sokeuden aiheuttajia teollisuusmaissa. Lääkkeenanto ja lääkeaineen pääsy silmän takaosan kudoksiin on kuitenkin hankalaa, ja annostelu joudutaan toteuttamaan kuukausittain annettavilla lasiaisen sisäisillä injektioilla. Nämä injektiot voivat olla epämiellyttäviä ja pelottavia potilaille, voivat aiheuttaa vakavia haittavaikutuksia ja kuormittavat terveydenhuoltoa. Siksi tarvitaankin pitkävaikutteisia, kohdennettuja lääkehoitoja helpottamaan silmän takaosan sairauksien hoitoa. Silmän etu- ja takaosassa on paljon melaniiniksi kutsuttua pigmenttiä. Melaniini sitoo useita lääkeaineita, ja sitoutuessaan melaniiniin lääkeainetta kertyy silmän pigmentoituneisiin kudoksiin. Melaniinisitoutumista voitaisiinkin mahdollisesti hyödyntää pidentämään lääkeaineen vaikutusta silmässä ja kohdentamaan hoitoa silmän pigmentoituneisiin kudoksiin. Tämän väitöstutkimuksen tavoitteena oli tutkia melaniinisitoutumisen vaikutusta lääkeaineiden kulkeutumiseen silmässä. Lisäksi tutkimme lääkeaineiden sitoutumista silmän lasiaiseen, sillä lasiaissitoutumisen vaikutus lääkeaineen vaiheisiin silmässä tunnetaan huonosti. Melaniini sijaitsee solujen sisällä melanosomeissa; soluelimissä, joita peittää lipidikalvo. Lääkeaineen tulee läpäistä sekä solu- että melanosomikalvo ennen kuin se pääsee sitoutumaan melaniiniin. Solutason tekijöiden, kuten solukalvon läpäisevyyden, vaikutus sitoutumiseen elimistössä tunnetaan huonosti. Tutkimmekin lääkeaineiden melaniinisitoutumisen ja solutason tekijöiden yhteisvaikutusta lääkeaineiden kulkeutumiseen silmässä. Tulosten perusteella voimme todeta, että melaniinisitoutuminen voi pidentää lääkeaineen viipymistä silmässä huomattavasti. Solukalvon läpäisevyys ja lääkeaineen sitoutuminen muihin solun osiin kuin melaniiniin vaikuttavat myös huomattavasti solutason sitoutumiseen. Huomioitavaa on, että suurin osa pigmentoituneissa kudoksissa olevasta melaniiniin sitoutuvasta lääkeaineesta on sitoutuneena, ja lääkeaineen tulee olla riittävän tehokas, jotta vapaana oleva lääkeainepitoisuus riittää vaikutuksen aikaansaamiseen. Lääkeaineiden sitoutuminen silmän lasiaiseen ei ole verrattavissa melaniinisitoutumiseen, eikä sillä ole suurta vaikutusta lääkeaineiden kulkeutumiseen silmässä. Tämä väitöskirjatyö tuotti tärkeää tietoa lääkeaineiden melaniinisitoutumisen vaikutuksesta niiden kulkuun silmässä. Melaniinisitoutuminen määrittää lääkeaineiden kertymistä silmään ja viipymistä silmän pigmentoituneissa kudoksissa, jotka ovat lääkehoidon kohteita monille silmän takaosan sairauksille. Väitöskirjatyössä luotuja menetelmiä ja tietokonemalleja voidaan käyttää lääkekehityksessä helpottamaan melaniinisitoutumisen tutkimista. Melaniinisitoutumisen hyödyntäminen silmälääkkeiden vaikutuksen kohdentamisessa ja pidentämisessä näyttää lupaavalta, mutta lisätutkimuksia tarvitaan ennen kuin tämä lähestymistapa saadaan toteutettua käytännössä

Terveydenedistämisaktiivisuutta perusterveydenhuollossa kuvaavat tunnusluvut ja niiden raportointi - menetelmäraportti

TedBM-hankkeessa kehitetyn terveydenedistämisaktiivisuuden (TEA) viitekehyksen ulottuvuuksia kuvaavien tunnuslukujen muodostamisprosessi; TEA-tunnusluvu

Melanin targeting for intracellular drug delivery: Quantification of bound and free drug in retinal pigment epithelial cells

Melanin binding affects drug distribution and retention in pigmented ocular tissues, thereby affecting drug response, duration of activity and toxicity. Therefore, it is a promising possibility for drug targeting and controlled release in the pigmented cells and tissues. Intracellular unbound drug concentrations determine pharmacological and toxicological actions, but analyses of unbound vs. total drug concentrations in pigmented cells are lacking. We studied intracellular binding and cellular drug uptake in pigmented retinal pigment epithelial cells and in non-pigmented ARPE-19 cells with five model drugs (chloroquine, propranolol, timolol, diclofenac, methotrexate). The unbound drug fractions in pigmented cells were 0.00016–0.73 and in non-pigmented cells 0.017–1.0. Cellular uptake (i.e. distribution ratio Kp), ranged from 1.3 to 6300 in pigmented cells and from 1.0 to 25 in non-pigmented cells. Values for intracellular bioavailability, Fic, were similar in both cells types (although larger variation in pigmented cells). In vitro melanin binding parameters were used to predict intracellular unbound drug fraction and cell uptake. Comparison of predictions with experimental data indicates that other factors (e.g. ion-trapping, lipophilicity-related binding to other cell components) also play a role. Melanin binding is a major factor that leads to cellular uptake and unbound drug fractions of a range of 3–4 orders of magnitude indicating that large reservoirs of melanin bound drug can be generated in the cells. Understanding melanin binding has important implications on retinal drug targeting, efficacy and toxicity.Peer reviewe