Modulación de sistemas de biotransformación y transportadores de drogas por benznidazol en la línea celular HepG2 : rol del receptor de pregnanos X

El efecto de un fármaco depende de su concentración en su sitio de acción. La misma se encuentra definida por la absorción, la distribución y la depuración del mismo. En el organismo pueden definirse órganos de relevancia farmacológica que cumplen una función importante en los procesos mencionados anteriormente. El hígado y el riñón cumplen un rol clave en la depuración de fármacos. El intestino participa además en la absorción de compuestos administrados en forma oral. Tanto en la limitación de la absorción a nivel intestinal como en la excreción en todos los tejidos mencionados intervienen sistemas de biotransformación y transportadores de drogas, proteínas que modifican químicamente los fármacos llevando en la mayoría de los casos a su inactivación y facilitando su posterior transporte fuera de la célula. Los sistemas de biotransformación pueden dividirse en sistemas de fase I y sistemas de fase II. Los sistemas de fase I incluyen a las proteínas de la familia del citocromo P450 y catalizan diversas reacciones de oxidoreducción. El miembro más representativo es el CYP3A4, responsable del metabolismo de aproximadamente el 50% de las drogas de aplicación clínica. Los sistemas de fase II catalizan reacciones de conjugación de los fármacos o los productos de la reacciones de fase I con compuestos como glutation (reacciones catalizadas por las glutation-S-transferasas, GSTs) o ácido glucurónico (reacciones catalizadas por las UDP-glucuronosiltransferasas, UGTs) entre otros. Las proteínas transportadoras suelen ser de carácter multiespecífico. Entre los transportadores de eflujo pueden mencionarse a la P-glicoproteína (P-gp), la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) y la proteína de resistencia de cáncer de mama (BCRP) de localización apical en hepatocitos, enterocitos y células de los túbulos renales. La proteína asociada a resistencia a multidrogas 3 (MRP3), por su parte, se localiza en las membranas basolaterales de los mencionados tipos celulares. La expresión y función de los sistemas anteriores no es constante sino que existe una regulación, por los mismos sustratos y por otras drogas, representando la base molecular de las interacciones droga-droga. La regulación puede cursar a nivel transcripcional (cambios en la síntesis de ARNm), nivel post-transcripcional (cambios en la estabilidad del ARNm o en su procesamiento), nivel traduccional (cambios en la síntesis de proteína) o a nivel post-traduccional (cambios en la actividad de la proteína sin cambios en su expresión). En el caso de la regulación por fármacos, la regulación transcripcional mediada por receptores nucleares suele ser uno de los mecanismos más importantes. El receptor de pregnanos X (PXR) es un receptor nuclear de elevada promiscuidad. El mismo es activado por un gran número de fármacos y otros xenobióticos y regula la expresión de diversos genes que codifican sistemas de biotransformación y transportadores de drogas. El Benznidazol (BZL) es el fármaco de elección para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Actualmente se dispone de escasa información acerca de los efectos del BZL sobre los sistemas de biotransformación y transportadores de drogas. Su coadministración con otros compuestos y, por ende, la aparición de interacciones droga-droga no puede ser descartada. Los objetivos del presente trabajo de tesis fueron: 1) establecer el efecto del tratamiento con BZL sobre la expresión y actividad de sistemas de biotransformación de fase I (CYP3A4), sistemas de biotransformación de fase II (GST y UGT) y proteínas transportadoras de drogas (P-gp, MRP2, BCRP y MRP3); 2) establecer el/los mediadores moleculares de tal efecto, en especial la participación de PXR y determinar el rol del BZL como activador de PXR y 3) estudiar el/los transportadores responsables del eflujo de BZL al exterior celular y cómo el pretratamiento con BZL afecta tal proceso. Los estudios se realizaron en la línea celular HepG2. La misma deriva de un hepatocarcinoma celular humano y conserva diversas propiedades bioquímicas, morfológicas y fisiológicas de los hepatocitos lo que la convierte en un modelo adecuado para estudiar la regulación de proteínas hepáticas humanas. En primer lugar se realizó un estudio concentración-respuesta (0-1000 μM) de la expresión de los transportadores en respuesta al tratamiento con BZL. Se observó una inducción significativa a nivel proteico (por inmunocuantificación) de P-gp por BZL 200 y 1000 μM (160 ± 27 y 282 ± 94% respectivamente vs 100 ± 7%). Un patrón similar se observó en la expresión de MRP2 (175 ± 15 y 491 ± 5% para 200 y 1000 μM de BZL respectivamente vs 100 ± 14%). BCRP y MRP3 no mostraron diferencias significativas a ninguna de las concentraciones estudiadas. La inducción de P-gp y MRP2 se verificó tanto en lisados celulares como en membrana plasmática. Para los estudios posteriores se escogió la concentración de BZL 200 μM por ser la mínima concentración a la que se observa un efecto. A nivel de ARNm (por PCR cuantitativa a tiempo real), se observó también una inducción de P-gp y MRP2 por BZL (200 μM). Concretamente la expresión fue de 332 ± 151 vs 100 ± 69% en el caso del mensajero de P-gp y 293 ± 137 vs 100 ± 57% en el caso de MRP2. La inducción observada en la expresión se correlacionó con un aumento en la actividad tanto para P-gp como para MRP2. En el primer caso la actividad se determinó por acumulación del sustrato modelo Rhodamina 123. Las células tratadas con BZL mostraron una acumulación significativamente menor (85 ± 2 vs 100 ± 6%) que las células controles, lo que indica un mayor eflujo del mismo, y esto una mayor actividad de P-gp. En el caso de MRP2, la actividad se determinó midiendo el eflujo del sustrato dinitrofenil-S-glutation (DNP-SG) observándose un eflujo significativamente mayor (181 ± 1 vs 100 ± 7%) en las células tratadas que en las células controles. A nivel de las enzimas de biotransformación, BZL (200 μM) indujo la expresión proteica de CYP3A4 y GSTπ (143 ± 1 vs 100 ± 22% y 175 ± 12 vs 100 ± 35%, respectivamente). La inducción se observó también a nivel del ARNm (150 ± 23 vs 100 ± 21% y 178 ± 94 vs 100 ± 11% para CYP3A4 y GSTπ respectivamente). También se observó una inducción en la actividad de GST, cuantificada a través de la formación de DNP-SG (204 ± 32 vs 100 ± 7%). La actividad de CYP3A4 se determinó por la formación de un derivado luminiscente a partir de un sustrato modelo de la enzima. Se observó una disminución en la actividad (58 ± 6 vs 100 ± 4%) que indica inhibición de la misma por BZL. A fin de caracterizar el mecanismo de acción del BZL en el modelo celular empleado se verificó por inmunocuantificación la expresión de PXR, el receptor X de retinoides α (RXRα) con el cual heterodimeriza PXR y del coactivador p300, necesario para la función de los mismos. Mediante sobreexpresión de PXR se observó una inducción en la expresión de genes blanco de PXR como ser P-gp, MRP2, MRP3 y BCRP, lo que indicaría funcionalidad de PXR en el modelo y posibilidad de mediación del efecto de BZL por el mismo. Para confirmar tal hipótesis, se procedió al silenciamiento de PXR empleando un ARN de interferencia específico dirigido contra el ARNm del receptor nuclear lográndose un silenciamiento de PXR a nivel de proteína del 74% con respecto a las células transfectadas con un ARN de interferencia no silenciante. En estas condiciones se repitió el tratamiento con BZL y se cuantificó la expresión de las proteínas cuya expresión había resultado previamente inducida (CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2). En todos los casos, el silenciamiento de PXR resultó en la ausencia de inducción por BZL confirmando la participación de PXR como mediador del efecto de BZL. A fin de determinar si el mecanismo por el cual PXR media el efecto de BZL consiste en una activación del mismo, se determinó la actividad del mismo en presencia de distintas concentraciones de BZL. Para ello se utilizaron células LS180-PXRRE, derivadas a partir de un adenocarcinoma de colon humano, que expresan en forma estable un gen reportero sensible a la activación de PXR. Por regresión sigmoidea se obtuvo un valor de concentración efectiva 50 (EC50) de 259 ± 38 μM corroborándose así el rol de BZL como activador de PXR y sugiriendo su rol como ligando del mismo. A fin de determinar el/los transportadores que mediarían el eflujo de BZL al exterior celular, se corroboró en primer lugar si el BZL sufre metabolización en las condiciones experimentales empleadas. Al no observarse metabolismo significativo, se procedió a realizar los estudios posteriores cuantificando la droga sin modificar (por HPLC). En primer lugar se determinó la acumulación intracelular de BZL luego de 2 h de incubación en presencia de verapamilo (como inhibidor de P-gp) o de probenecid (como inhibidor de las MRPs). Se observó una acumulación significativamente mayor en las células coincubadas con verapamilo respecto de las células controles no expuestas a ningún inhibidor (128 ± 16 vs 100 ± 3%) sugiriendo la dependencia del transporte de BZL, al menos en parte, de P-gp. No se observaron cambios significativos en la acumulación de BZL en las células coincubadas con probenecid (88 ± 8 vs 100 ± 3%) permitiendo descartar la participación de una MRP en el transporte de BZL, al menos en su forma sin modificar. A fin de confirmar la participación de P-gp en el transporte de BZL en células HepG2, se procedió a su silenciamiento mediante transfección con un ARN de interferencia. Se observó una acumulación significativamente mayor de BZL en las células P-gp-, transfectadas con un ARN de interferencia específico contra P-gp, que en células P-gp+, transfectadas con un ARN de interferencia no silenciante (115 ± 2 vs 100 ± 3%) confirmando la participación de P-gp en el transporte de BZL. Teniendo en cuenta que P-gp participa en el transporte de BZL y que el pretratamiento con BZL induce la expresión de P-gp, es esperable que el pretratamiento con BZL modifique su propia concentración intracelular. A fin de corroborarlo se repitió determinó la acumulación de BZL en condiciones de inducción de P-gp por el fármaco (200 μM, 48 h). Se observó una acumulación significativamente menor de BZL en las células que fueron pretratadas con respecto a las células controles expuestas al vehículo (73 ± 15 vs 100 ± 2%). El efecto desaparece ante el agregado de verapamilo (inhibidor de P-gp), donde la acumulación en células controles y pretratadas con BZL no difiere estadísticamente (120 ± 4 y 115 ± 5% respectivamente) confirmando así la participación de P-gp. Los resultados del presente trabajo de tesis demuestran un efecto inductor del tratamiento con BZL sobre la expresión de CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2. La inducción de la expresión en GSTπ, P-gp y MRP2 se refleja en un aumento en la actividad de las proteínas empleando sustratos modelos de cada proteína. La inducción sugeriría un aumento en la depuración de fármacos sustratos de los mismos cuando estos son coadministrados con BZL. Además se confirmó el rol de P-gp en el transporte de BZL, lo que podría también representar la base de interacciones droga-droga en el caso de que el BZL sea administrado en condiciones de inducción de P-gp por otra droga. Simultáneamente, dado su carácter inductor de P-gp, BZL por si solo sería capaz de aumentar su propia depuración. En el caso de CYP3A4 por el contrario se observa un efecto inhibitorio sobre la actividad. Teniendo en cuenta que el CYP3A4 es responsable del metabolismo de aproximadamente el 50% de los fármacos de empleo en la práctica clínica, de observarse un efecto similar in vivo, el tratamiento con BZL podría disminuir la depuración de sustratos coadministrados propiciando la aparición de interacciones droga-droga y efectos potencialmente tóxicos. Además, se demostró la participación de PXR en la regulación del efecto y se confirmó la activación del receptor nuclear por BZL. Teniendo en cuenta que el mecanismo de activación descrito para PXR implica unión del sustrato al bolsillo hidrofóbico del dominio de unión a ligando, los resultados sugerirían un rol de BZL como ligando del mismo. No obstante, se requeriría la confirmación mediante ensayos de competición. Por otro lado, PXR cumple un rol regulador clave sobre un gran número de sistemas de biotransformación y transportadores de drogas como así también sobre genes que regulan otras vías metabólicas (ej. síntesis de ácidos biliares) e interacciona con otras vías de transducción de señales (ej. respuesta inflamatoria, ciclo celular). Por lo tanto, no pueden descartarse potenciales interacciones entre BZL y las mencionadas vías de señalización.Fil: Rigalli, Juan Pablo. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Fisiología. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Instituto de Fisiología Experimental (IFISE-CONICET); Argentina

Induction of hepatic multidrug resistance-associated protein 3 by ethynylestradiol is independent of cholestasis and mediated by estrogen receptor

Multidrug resistance–associated protein 3 (Mrp3; Abcc3) expression and activity are up-regulated in rat liver after in vivo repeated administration of ethynylestradiol (EE), a cholestatic synthetic estrogen, whereas multidrug resistance-associated protein 2 (Mrp2) is down-regulated. This study was undertaken to determine whether Mrp3 induction results from a direct effect of EE, independent of accumulation of any endogenous common Mrp2/Mrp3 substrates resulting from cholestasis and the potential mediation of estrogen receptor (ER). In in vivo studies, male rats were given a single, noncholestatic dose of EE (5 mg/kg s.c.), and basal bile flow and the biliary excretion rate of bile salts and glutathione were measured 5 hours later. This treatment increased Mrp3 mRNA by 4-fold, detected by real-time polymerase chain reaction, despite the absence of cholestasis. Primary culture of rat hepatocytes incubated with EE (1–10 µM) for 5 hours exhibited a 3-fold increase in Mrp3 mRNA (10 µM), consistent with in vivo findings. The increase in Mrp3 mRNA by EE was prevented by actinomycin D, indicating transcriptional regulation. When hepatocytes were incubated with an ER antagonist [7α,17β-[9-[(4,4,5,5,5-Pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1,3,5(10)-triene-3,17-diol (ICI182/780), 1 µM], in addition to EE, induction of Mrp3 mRNA was abolished, implicating ER as a key mediator. EE induced an increase in ER-α phosphorylation at 30 minutes and expression of c-Jun, a well-known ER target gene, at 60 minutes, as detected by Western blotting of nuclear extracts. These increases were prevented by ICI182/780. In summary, EE increased the expression of hepatic Mrp3 transcriptionally and independently of any cholestatic manifestation and required participation of an ER, most likely ER-α, through its phosphorylation.Fil: Ruiz, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Rigalli, Juan Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Arias, Agostina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Villanueva, Silvina Stella Maris. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Banchio, Claudia Elena. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Vore, Mary. University Of Kentucky; Estados UnidosFil: Mottino, Aldo Domingo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Catania, Viviana Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentin

Biphasic modulation of cAMP levels by the contraceptive nomegestrol acetate. Impact on P-glycoprotein expression and activity in hepatic cells

ABC transporters are key players in drug excretion with alterations in their expression and activity by therapeutic agents potentially leading to drug-drug interactions. The interaction potential of nomegestrol acetate (NMGA), a synthetic progestogen increasingly used as oral contraceptive, had never been explored. In this work we evaluated (1) the effect of NMGA on ABC transporters in the human hepatic cell line HepG2 and (2) the underlying molecular mechanism. NMGA (5, 50 and 500 nM) increased P-glycoprotein (P-gp) expression at both protein and mRNA levels and reduced intracellular calcein accumulation, indicating an increase also in transporter activity. This up-regulation of P-gp was corroborated in Huh7 cells and was independent of the classical progesterone receptor. Instead, using a siRNA-mediated silencing approach, we demonstrated the involvement of membrane progesterone receptor α. Moreover, we found that the activation of this receptor by NMGA led to a falling-rising profile in intracellular cAMP levels and protein kinase A activity over time, ultimately leading to transcriptional P-gp up-regulation. Finally, we identified inhibitory G protein and phosphodiesterases as mediators of this novel biphasic modulation. These results demonstrate the ability of NMGA to selectively up-regulate hepatic P-gp expression and activity and constitute the first report of ABC transporter modulation by membrane progesterone receptor α. If a similar regulation took place in vivo, decreased bioavailability and therapeutic efficacy of NMGA-coadministered P-gp substrates could be expected. This holds special importance considering long-term administration of NMGA and broad substrate specificity of P-gp.Fil: Tocchetti, Guillermo Nicolás. University of Heidelberg; Alemania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Dominguez, Camila Juliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Zecchinati, Felipe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Arana, Maite Rocío. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Ruiz, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Villanueva, Silvina Stella Maris. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Weiss, Johanna. University of Heidelberg; AlemaniaFil: Mottino, Aldo Domingo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Rigalli, Juan Pablo. University of Heidelberg; Alemania. Radboud Universiteit Nijmegen; Países Bajos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Regulation of biotransformation systems and ABC transporters by Benznidazole in HepG2 cells: involvement of Pregnane X-Receptor

Background: Benznidazole (BZL) is the only antichagasic drug available in most endemic countries. Its effect on the expression and activity of drug-metabolizing and transporter proteins has not been studied yet. Methodology/Principal Findings: Expression and activity of P-glycoprotein (P-gp), Multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2), Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), and Glutathione S-transferase (GST) were evaluated in HepG2 cells after treatment with BZL. Expression was estimated by immunoblotting and real time PCR. P-gp and MRP2 activities were estimated using model substrates rhodamine 123 and dinitrophenyl-S-glutathione (DNP-SG), respectively. CYP3A4 and GST activities were evaluated through their abilities to convert proluciferin into luciferin and 1-chloro-2,4-dinitrobenzene into DNP-SG, respectively. BZL (200 µM) increased the expression (protein and mRNA) of P-gp, MRP2, CYP3A4, and GSTπ class. A concomitant enhancement of activity was observed for all these proteins, except for CYP3A4, which exhibited a decreased activity. To elucidate if pregnane X receptor (PXR) mediates BZL response, its expression was knocked down with a specific siRNA. In this condition, the effect of BZL on P-gp, MRP2, CYP3A4, and GSTπ protein up-regulation was completely abolished. Consistent with this, BZL was able to activate PXR, as detected by reporter gene assay. Additional studies, using transporter inhibitors and P-gp-knock down cells, demonstrated that P-gp is involved in BZL extrusion. Pre-treatment of HepG2 cells with BZL increased its own efflux, as a consequence of P-gp up-regulation. Conclusions/Significance: Modifications in the activity of biotransformation and transport systems by BZL may alter the pharmacokinetics and efficiency of drugs that are substrates of these systems, including BZL itself.Fil: Rigalli, Juan Pablo. Universität Heidelberg; Alemania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Perdomo, Virginia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Luquita, Marcelo Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Villanueva, Silvina Stella Maris. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Arias, Agostina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Theile, Dirk. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Weiss, Johanna. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Mottino, Aldo Domingo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Ruiz, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Catania, Viviana Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentin

Estrogen receptor- mediates human multidrug resistance associated protein 3 induction by 17-ethynylestradiol. Role of activator protein-1

Previously, we have demonstrated that 17α-ethynylestradiol (EE) induces rat multidrug-resistance associated protein 3 (Mrp3, Abcc3) expression transcriptionally through estrogen receptor-α (ER-α) activation. We explored the effect of EE on MRP3 expression of human origin. HepG2 cells were transfected with ER-α and incubated with EE (1–10–50 μM) for 48 h. MRP3 protein and mRNA levels were measured by Western blotting and Real time PCR, respectively. EE up-regulated MRP3 protein and mRNA at 50 μM only in ER-α(+)-HepG2 cells. The in silico analysis of mrp3 promoter region demonstrated absence of estrogen response elements, but showed several Ap-1 binding sites. We further evaluated the potential involvement of the transcription factors c-JUN and c-FOS (members of Ap-1) in MRP3 up-regulation. ER-α(+) HepG2 cells were incubated with EE and c-FOS and c-JUN levels measured by Western blotting in nuclear extracts. EE up-regulated only c-JUN. Experiments of overexpression and knock-down of c-JUN by siRNA further demonstrated that this transcription factor is indeed implicated in MRP3 upregulation by EE. Co-immunoprecipitation assay demonstrated that EE induces c-JUN/ER-α interaction, and chromatin immunoprecipitation assay showed that this complex is recruited to the AP-1 binding consensus element present at the position (−1300/−1078 bp) of human mrp3 promoter. We conclude that EE induces MRP3 expression through ER-α, with recruitment of ER-α in complex with c-JUN to the human mrp3 promoter.Fil: Ruiz, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Rigalli, Juan Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Arias, Agostina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Villanueva, Silvina Stella Maris. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Banchio, Claudia Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Vore, Mary. University Of Kentucky; Estados UnidosFil: Mottino, Aldo Domingo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Catania, Viviana Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); Argentin

Antiproliferative efficacies but minor drug transporter inducing effects of paclitaxel, cisplatin, or 5-fluorouracil in a murine xenograft model for head and neck squamous cell carcinoma

Drug-induced multidrug resistance (MDR) has been linked to overexpression of drug transporting proteins in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in vitro. The aim of this work was to reassess these findings in a murine xenograft model. NOD-SCID mice xenotransplanted with 106 HNO97 cells were treated for four consecutive weeks with weekly paclitaxel, biweekly cisplatin (both intraperitoneal), or 5-fluorouracil (5-FU, administered by osmotic pump). Tumor volume and body weight were weekly documented. Expression of drug transporters and Ki-67 marker were examined using quantitative real-time polymerase chain reaction and/or immunohistochemistry. Both paclitaxel and cisplatin significantly reduced tumor volumes after 2–3 weeks. 5-FU-treated animals had significantly lower body weights after 2 or 4 weeks of chemotherapy. None of the drugs affected expression of drug transporters at the mRNA level. However, P-glycoprotein (Pgp) protein expression was increased by paclitaxel (P < 0.01). Ki-67 expression did not change during treatment irrespective of the drug applied. Paclitaxel and cisplatin are effectively tumor volume reducing drugs in a murine xenograft model of HNSCC. Paclitaxel enhanced Pgp expression at the protein level, but not at the mRNA level suggesting transcriptional induction to be of minor relevance. In contrast, posttranscriptional mechanisms or Darwinian selection of intrinsically drug transporter overexpressing MDR cells might lead to iatrogenic chemotherapy resistance in HNSCC.Fil: Theile, Dirk. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Gal, Zoltan. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Warta, Rolf. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Rigalli, Juan Pablo. Universität Heidelberg; Alemania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Lahrmann, Bernd. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Grabe, Niels. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Herold Mende, Christel. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Dyckhoff, Gerhard. Universität Heidelberg; AlemaniaFil: Weiss, Johanna. Universität Heidelberg; Alemani

Fluoride increases superoxide production and impairs the respiratory chain in ROS 17/2.8 osteoblastic cells.

It is known that fluoride produces oxidative stress. Inflammation in bone tissue and an impairment of the respiratory chain of liver have been described in treatments with fluoride. Whether the impairment of the respiratory chain and oxidative stress are related is not known. The aim of this work was to study the effects of fluoride on the production of superoxide radical, the function of the respiratory chain and the increase in oxidative stress in ROS 17/2.8 osteoblastic cells. We measured the effect of fluoride (100 µM) on superoxide production, oxygen consumption, lipid peroxidation and antioxidant enzymes activities of cultured cells following the treatment with fluoride. Fluoride decreased oxygen consumption and increased superoxide production immediately after its addition. Furthermore, chronic treatment with fluoride increased oxidative stress status in osteoblastic cells. These results indicate that fluoride could damage bone tissue by inhibiting the respiratory chain, increasing the production of superoxide radicals and thus of the others reactive oxygen species

Modulation of ABC Transporters by Nuclear Receptors: Physiological, Pathological and Pharmacological Aspects

ABC transporters are membrane proteins mediating the efflux of endo- and xenobiotics. Transporter expression is not static but instead is subject to a dynamic modulation aiming at responding to changes in the internal environment and thus at maintaining homeostatic conditions. Nuclear receptors are ligand modulated transcription factors that get activated upon changes in the intracellular concentrations of the respective agonists and bind to response elements within the promoter of ABC transporters, thus modulating their expression and, consequently, their activity. This review compiles information about transporter regulation by nuclear receptors classified according to the perpetrator compounds and the biological effects resulting from the regulation. Modulation by hormone receptors is involved in maintaining endocrine homeostasis and may also lead to an altered efflux of other substrates in cases of altered hormonal levels. Xenobiotic receptors play a key role in limiting the accumulation of potentially harmful compounds. In addition, their frequent activation by therapeutic agents makes them common molecular elements mediating drug-drug interactions and cancer multidrug resistance. Finally, lipid and retinoid receptors are usually activated by endogenous molecules, thus sensing metabolic changes and inducing ABC transporters to counteract potential alterations. Furthermore, the axis nuclear receptor-ABC transporter constitutes a promising therapeutic target for the treatment of several disease states like cancer, atherosclerosis and dyslipidemia. In the current work, we summarize the information available on the pharmacological potential of nuclear receptor modulators and discuss their applicability in the clinical practice.Fil: Rigalli, Juan Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina. University of Heidelberg; AlemaniaFil: Tocchetti, Guillermo Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina. University of Heidelberg; AlemaniaFil: Weiss, Johanna. University of Heidelberg; Alemani

Oxygen uptake rate (VO₂) in ROS 17/2.8 cells.

<p>VO₂ in the absence (Basal) or presence (NaF) of different concentrations of F- (10, 50, 100 µM). Points and segments represent mean and SD respectively. *Significant differences compared to Basal VO₂ (before the exposure to F), Paired Student’s t-test, n = 7, p<0.05.</p

Respiratory complexes activities of isolated mitochondria.

<p>Activities of complex I–III (C I–III), complex II-III (C II–III) and complex IV (C IV) of isolated mitochondria from experimental groups expressed as percentage of the Control group. Data are shown as mean ± SD (n = 3). *Significantly different to Control, Student’s t test, p<0.05.</p