Fibronectin cues during somite formation

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013The formation of the string of individual somite segments is a hallmark morphogenetic event during embryonic development, establishing the basic foundations of the vertebrate body. Somites pinch off from the mesenchymal presomitic mesoderm on either side of the neural tube, as epithelial blocks of cells, with a strict chronological sequence in a rostral to caudal fashion. In recent decades, the intense scrutiny and investigation on the temporal and spatial regulation of somitogenesis has produced a fascinating picture on the mechanisms underlying vertebrate embryo segmentation. However, our knowledge regarding the cellular performance involved in the detachment and individualization of the somitic segment remains quite obscure. The extracellular matrix molecule fibronectin has been implicated in somitogenesis since its discovery and its role was reinforced with the genetic deletion in the mouse embryo, but how fibronectin participates in the formation of the epithelial somite is still unclear. The aim of this thesis is to investigate how the interaction between the presomitic mesoderm cells and the fibronectin matrix contributes to the detachment of the somite sphere of epithelial cells, using the chicken embryo as a model. In Chapter 2 we first resolve the disputed role of the ectoderm overlying the presomitic mesoderm, showing that is serves as a source of fibronectin, which becomes assembled as a fibrillar matrix around the presomitic mesoderm, supporting somite formation. Through microsurgical explant collection and culture we show for the first time that a presomitic mesoderm isolated from all surrounding tissues can undergo somitogenesis provided that the original fibrillar fibronectin sleeve is preserved. In Chapter 3 and 4 we adopt a three-dimensional view of somite formation, evaluating in detail the cellular rearrangements underlying somitogenesis (Chapter 3) and the architecture of the fibronectin matrix along the full extent of the presomitic mesoderm and somites (Chapter 4). The combination of time-lapsed movies and explant culture analysis presented in Chapter 3 revealed that intersomitic cleft formation is mostly driven by the cells in the rostral border and that mesenchymal cells from the central locations contribute to the outer epithelial layer of somites. The high-resolution analysis of the extracellular matrix displayed in Chapter 4 revealed that an increased fibrillar complexity of the fibronectin matrix accompanies presomitic mesoderm maturation, preluding somite formation. We co-analyzed the distribution of the epithelium-associated extracellular molecule laminin and found, together with our observations in Chapter 2 that it does not contribute to the epithelialization of the somite. The thorough analysis in this Chapter is also one of the few detailed evaluations of extracellular matrix component assembly in a complex three-dimensional in vivo tissue. In the final chapter, Chapter 5, we investigate the role of cell tension, elicited by the cell attachment to its milieu, in the epithelialization and detachment of somites. The epithelialization process is abrogated by specific cell tension inhibitors, but already formed somites can partially maintain their epithelial organization. Remarkably, these inhibitors also interfere with the spatial regulation of Meso1 expression, a key gene underlying both the location of the future somite boundary and the establishment of the rostral-caudal polarity of the somite segment. In combination with the previous chapters, these results indicate that the assembly of a fibronectin matrix along the caudal-rostral axis of the presomitic maturation is a part of the maturation process: the increased fibrillar complexity provides the tensional support for both the cell rearrangements essential for somite detachment, epithelialization of the peripheral cells and apparently also as a spatial cue influencing the developmental programs of the presomitic mesoderm. Overall, this thesis demonstrates the prominent role of the fibronectin extracellular matrix during somitogenesis in the chicken embryo. The results obtained highlight that the extracellular matrix dimension is a worthy player during embryonic development.O esquema geral do desenvolvimento embrionário dos Vertebrados é marcado por duas conspícuas fileiras de elementos repetidos, situadas em ambos os lados do tubo neural, localizado numa posição axial. Estas estruturas repetidas, chamadas sómitos, vão originar os elementos ósseos que compõem o esqueleto axial, as vértebras, de onde deriva o nome deste sub-filo. Os sómitos dão também origem à musculatura esquelética do tronco e membros, assim como à derme das costas, entre outros tecidos. Os sómitos são originários de um tecido mesodérmico não-segmentado, de forma cilíndrica, situado em ambos os lados do tubo/placa neural, tecido esse que é denominado mesoderme pré-somítica (MPS). Em conjunto, os sómitos e as MPS compõem a mesoderme paraxial (i.e. a mesoderme imediatamente lateral ao eixo central). Cada par de sómitos destaca-se, de um modo temporal e espacialmente regulado, da extremidade mais rostral da MPS, originando um gradiente caudo-rostral de crescente maturação somítica. Ao mesmo tempo, o embrião continua a alongar-se no sentido caudal, e a gastrulação que decorre no botão caudal acrescenta celulas à MPS mesenquimatosa A formação de cada sómito epitelial é acompanhada por um processo de transição mesênquima epitélio, resultando na formação de uma esfera de células epiteliais rodeando um núcleo de células mesenquimatosas. A formação dos sómitos não só é importante para a formação das vértebras e outros tecidos que deles directamente derivam, mas também são responsáveis pela imposição do arranjo segmentado do sistema nervoso periférico. Embora a formação dos sómitos intrigue observadores desde tempos longínquos, as mais recentes décadas foram fundamentais para elucidar alguns dos aspectos mais intrigantes deste fenómeno. Dada a importância estrutural dos sómitos em todo o desenvolvimento embrionário subsequente, a estrita regulação temporal e espacial da somitogénese foi alvo de um interesse superior, que culminou com a descoberta da primeira evidência da regulação temporal. Genes com um comportamento transcripcional cíclico, adequadamente denominados “genes cíclicos”, dos quais Hairy1 foi o primeiro descrito, evidenciaram a existência de um mecanismo metrónomo (oscilador), essencial para a regulação temporal da somitogénese em embriões de galinha. Posteriormente foi descoberta a existência de um gradiente de maturação caudo-rostral ao longo da MPS que balizava, a um nível hipotético do gradiente, a actividade do oscilador, transformando-a num localização espacial na MPS, coincidente com a formação de um segmento somítico. Estas evidências despoletaram toda uma nova compreensão do fenómeno, não só do ponto de vista conceptual como mecanístico, não obstante o mecanismo de oscilador-gradiente para a produção regular de segmentos já tivesse sido postulado anteriormente por modelos matemáticos. Embora nos dias de hoje já tenhamos uma ideia bastante robusta de como a somitogénese é regulada, ainda são numerosas as questões basilares cujas respostas ainda permanecem pouco claras. Nesta tese pretendemos abordar o fenómeno da somitogénese num dos aspectos que tem sido mais negligenciado: a formação morfológica de estruturas epiteliais, individuais, discretas – os sómitos -, a partir de um tecido mesenquimatoso, uniforme e não-segmentado – a MPS. Durante a somitogénese as células da MPS rostral rearranjam-se de um modo rápido e dramático, formando uma fenda transversal, e destacando-se da MPS remanescente sob a forma de uma esfera epitelial. A formação de sómitos é um fenómeno extremamente robusto, ocorrendo mesmo quando genes envolvidos na regulação espácio-temporal são geneticamente removidos. Embora os mecanismos envolvidos na formação dos sómitos ainda sejam pouco claros, a investigação de outros fenómenos morfogenéticos embrionários têm revelado que o seu enquadramento extracelular é essencial na orquestração dos comportamentos celulares subjacentes à criação de novas formas. Nesta tese procurámos aprofundar a compreensão da formação dos sómitos no embrião de galinha, explorando a interacção entre as células das MPS e os componentes não-celulares presentes no espaço extracelular, conjuntamente denominados matriz extracelular (MEC). Em particular, investigámos o papel da fibronectina, uma glicoproteína da MEC, durante a formação do sómito epitelial. De entre as várias moléculas que compõem a MEC, a fibronectina encontra-se presente de um modo ubíquo durante a embriogénese mas também em tecidos adultos. A fibronectina é polimerizada numa complexa rede de fibrilhas num processo totalmente dependente de uma acção celular. Décadas de investigação em células em cultura revelaram que a fibronectina é secretada como um dímero numa conformação compacta, e a molécula é estendida através de ligações às células, expondo locais essenciais para a polimerização. A fibronectina é uma molécula de adesão por excelência, regularmente associada a fenómenos de fixação, num contexto de migração e dispersão celular. Assim como a fibronectina, outros componentes da MEC não só albergam passivamente as células, mas também desempenham um papel instrutivo na regulação do comportamento celular. A laminina, uma outra glicoproteína da MEC estudada nesta tese, é um componente essencial da membrana basal, uma MEC especializada, crítica para a formação e manutenção de tecidos epiteliais. As células obtêm a informação sobre a MEC circundante através de receptores transmembranares denominados integrinas. Estes receptores heterodiméricos são transductores de sinais importantíssimos, que, embora não sejam transmissores de sinais per se, interagem com inúmeras moléculas de variadas vias sinalizadoras. As integrinas servem também como o elo de ligação físico entre o cito-esqueleto das células e a MEC, participando assim não só na avaliação bioquímica da MEC, como também das suas propriedades mecânicas. A interacção célula-MEC na regulação do comportamento celular tem sido alvo de investigação particularmente em células em cultura e num contexto patológico, sendo que o seu papel no desenvolvimento embrionário ainda não mereceu a devida atenção. Embora a deleção de vários genes para componentes da MEC tenham demonstrado claramente o seu papel fundamental nos estádios iniciais de desenvolvimento, os pormenores do papel da respectiva MEC em fenómenos mais particulares carecem de explicação. Notoriamente, a deleção do gene que codifica a fibronectina resulta numa letalidade embrionária precoce, e na completa ausência de sómitos embora a mesoderme paraxial seja formada normalmente, um fenótipo singular de entre as inúmeras deleções genéticas afectando a somitogénese. No entanto, e apesar de a fibronectina ter sido implicada na somitogénese noutros vertebrados-modelo, pouco se sabe do papel da matriz de fibronectina neste evento morfogenético. Numa primeira fase, esta tese pretendeu resolver uma série de observações respeitantes à capacidade da MPS de formar sómitos na presença ou ausência de tecidos circundantes, nomeadamente, a ectoderme, colocada dorsalmente à mesoderme paraxial. No capítulo 2 desta tese evidenciamos que a somitogénese ocorria em MPS isoladas de todos os tecidos circundantes, ao contrário das numerosas observações anteriores, mas apenas se a matriz de fibronectina original for mantida. Neste capítulo demonstramos que a ectoderme serve a formação de sómitos como um parceiro na formação da matriz de fibronectina e não como uma fonte de factores parácrinos. Em combinação com o capítulo 4, esta tese revela que a ectoderme é uma importante fonte de produção de fibronectina, e que conformações globulares de fibronectina estão localizadas no seu lado basal. Este capítulo 2 não só clarifica a função da ectoderme, indicando como certas idiossincrasias metodológicas resultaram nas observações anteriores, como também reforça a noção da autonomia do programa genético na MPS mais rostral. Dado a complexidade de um tecido embrionário que se estende em todas as direccões, no capítulo seguinte investigamos o fenómeno da formação da fenda intersomitica de um ponto de vista tridimensional. Aprimorando a visualização in vivo e em “time-lapse” da somitogénese, constatámos a complexidade dos movimentos celulares envolvidos na formação da fenda e no rearranjo de um novo sómito. Neste capítulo 3 foi dado um enorme passo na compreensão da somitogénese numa perspectiva tri-dimensional de primeira linha. Esta nova perspectiva e a respectiva melhoria tecnológica e metodológica derivados deste trabalho possibilitaram e levaram a uma avaliação detalhada da ECM explanada no capítulo seguinte. No capítulo 4, foi feito um extenso mapeamento da MEC ao longo do eixo caudal-rostral da mesoderme paraxial. Esta abordagem não só acompanhou as alterações da matriz de fibronectina e laminina durante o desenvolvimento deste tecido, como também evidenciou pela primeira vez, os passos iniciais na formação in vivo e em 3D destas matrizes. Uma vez que na sua extremidade caudal, a MPS mesenquimatosa é o resultado directo da gastrulação, onde a MEC original é degradada, o eixo caudal-rostral reflecte a formação de novo da matriz de fibronectina e laminina. Ao longo da mesoderme paraxial, a fibronectina torna-se crescentemente mais densa e fibrilar, mas após a formação do sómito a laminina passa a ocupar o espaço junto das células e a matriz de fibronectina fica claramente exterior à membrana basal. Neste capítulo reforçamos a importância de uma matriz densa e fibrilar de fibronectina durante a formação do sómito epitelial, tal como demonstrado no capítulo 2, mas não da laminina, quase ausente. Adicionalmente, o acompanhamento da matriz de laminina revelou que a sua montagem ocorre de um modo fragmentado e disperso. Inesperadamente, observámos que os fragmentos de laminina crescem e coalescem, mas sem nunca formarem uma membrana basal contínua rodeando o sómito epitelial ou o seu derivado epitelial, o dermomiótomo. No capítulo experimental final (capítulo 5) investigamos o papel da tensão celular na somitogénese, assumindo o princípio provável que a MEC rodeando a mesoderme paraxial serve como um suporte físico para as células da MPS e dos sómitos. Neste capítulo foram utilizados inibidores de tensão celular, prevenindo a capacidade das células não só de usarem mecanicamente a MEC, como de percepcionar as características mecânicas da MEC. Este trabalho revelou que o carácter epitelial dos sómitos normalmente surge imediatamente após o seu descolamento da MPS rostral, reforçando a integridade do segmento. Na presença de inibidores da tensão celular, o carácter epitelial em aquisição é perdido, mas os sómitos epiteliais mantêm pelo menos parcialmente a sua forma, demonstrando alguma robustez. A presença de inibidores de tensão, em particular, inibidores de vias próximas da sinalização mediada por integrinas, alteraram também o programa genético na MPS, revelando uma possível regulação mecanosensitiva da resposta aos gradientes subjacentes à determinação da MPS rostral. Em conjunto, esta tese evidenciou que a contínua montagem de uma matriz de fibronectina, numa conjugação de esforços pela ectoderme e pela MPS, acompanha o desenvolvimento da mesoderme paraxial, levando ao estabelecimento de uma matriz madura, capaz de suportar a formação de sómitos e de manter os segmentos separados. Mostramos também que a complexa orquestração dos movimentos celulares durante a somitogénese requer um sinal polarizador da fibronectina (provavelmente com um valor mecânico), efectuador da epitelização do sómito e no processo separador da fenda intersomítica. São lançadas também hipóteses de como a matriz de fibronectina se integra noutros mecanismos durante a formação da fenda, e na regulação tenso- mecânica da integração dos gradientes que definem espacialmente a MPS determinada mais rostral.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/37423/207, projectos PPCDT/BIA-BCM/59201/2004, PTDC/SAU-OBD/103771/2008) e European Union FP6 Network of Excellence ‘Cells into Organs’ (2004-2009

Redefining the role of ectoderm in somitogenesis: a player in the formation of the fibronectin matrix of presomitic mesoderm

The absence of ectoderm impairs somite formation in cultured presomitic mesoderm (PSM) explants, suggesting that an ectoderm-derived signal is essential for somitogenesis. Here we show in chick that the standard enzymatic treatments used for explant isolation destroy the fibronectin matrix surrounding the anterior PSM, which fails to form somites when cultured for 6 hours. By contrast, explants isolated with collagenase retain their fibronectin matrix and form somites under identical culture conditions. The additional presence of ectoderm enhances somite formation, whereas endoderm has no effect. Furthermore, we show that pancreatin-isolated PSM explants cultured in fibronectin-supplemented medium, form significantly more somites than control explants. Interestingly, ectoderm is the major producer of fibronectin (Fn1) transcripts, whereas all but the anterior-most region of the PSM expresses the fibronectin assembly receptor, integrin alpha5 (Itga5). We thus propose that the ectoderm-derived fibronectin is assembled by mesodermal alpha5beta1 integrin on the surface of the PSM. Finally, we demonstrate that inhibition of fibronectin fibrillogenesis in explants with ectoderm abrogates somitogenesis. We conclude that a fibronectin matrix is essential for morphological somite formation and that a major, previously unrecognised role of ectoderm in somitogenesis is the synthesis of fibronectin.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/FEDER projects POCTI/BCI/40754/2001 and POCI/BIA-BCM/59201/2004 and the FP6/EU Network of Excellence ‘Cells into Organs’ of which P.R., C.L., R.P.A., G.R., I.P. and S.T. are members. L.C. was supported by the European Social Fund contract 1/3.2/PRODEP/2001. R.P.A. was supported by FCT (SFRH/BPD/9432/2002)

Cell–fibronectin interactions and actomyosin contractility regulate the segmentation clock and spatio-temporal somite cleft formation during chick embryo somitogenesis

Fibronectin is essential for somite formation in the vertebrate embryo. Fibronectin matrix assembly starts as cells emerge from the primitive streak and ingress in the unsegmented presomitic mesoderm (PSM). PSM cells undergo cyclic waves of segmentation clock gene expression, followed by Notch-dependent upregulation of meso1 in the rostral PSM which induces somite cleft formation. However, the relevance of the fibronectin matrix for these molecular processes remains unknown. Here, we assessed the role of the PSM fibronectin matrix in the spatio-temporal regulation of chick embryo somitogenesis by perturbing (1) extracellular fibronectin matrix assembly, (2) integrin–fibronectin binding, (3) Rho-associated protein kinase (ROCK) activity and (4) non-muscle myosin II (NM II) function. We found that integrin–fibronectin engagement and NM II activity are required for cell polarization in the nascent somite. All treatments resulted in defective somitic clefts and significantly perturbed meso1 and segmentation clock gene expression in the PSM. Importantly, inhibition of actomyosin-mediated contractility increased the period of hairy1/hes4 oscillations from 90 to 120 min. Together, our work strongly suggests that the fibronectin–integrin–ROCK–NM II axis regulates segmentation clock dynamics and dictates the spatio-temporal localization of somitic clefts.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of amniote embryos

Vertebrate embryos are characterized by an elongated antero-posterior (AP) body axis, which forms by progressive cell deposition from a posterior growth zone in the embryo. Here, we used tissue ablation in the chicken embryo to demonstrate that the caudal presomitic mesoderm (PSM) has a key role in axis elongation. Using time-lapse microscopy, we analysed the movements of fluorescently labelled cells in the PSM during embryo elongation, which revealed a clear posterior-to-anterior gradient of cell motility and directionality in the PSM. We tracked the movement of the PSM extracellular matrix in parallel with the labelled cells and subtracted the extracellular matrix movement from the global motion of cells. After subtraction, cell motility remained graded but lacked directionality, indicating that the posterior cell movements associated with axis elongation in the PSM are not intrinsic but reflect tissue deformation. The gradient of cell motion along the PSM parallels the fibroblast growth factor (FGF)/mitogen-activated protein kinase (MAPK) gradient1, which has been implicated in the control of cell motility in this tissue2. Both FGF signalling gain- and loss-of-function experiments lead to disruption of the motility gradient and a slowing down of axis elongation. Furthermore, embryos treated with cell movement inhibitors (blebbistatin or RhoK inhibitor), but not cell cycle inhibitors, show a slower axis elongation rate. We propose that the gradient of random cell motility downstream of FGF signalling in the PSM controls posterior elongation in the amniote embryo. Our data indicate that tissue elongation is an emergent property that arises from the collective regulation of graded, random cell motion rather than by the regulation of directionality of individual cellular movements

Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis

Somites are transient segments formed in a rostro-caudal progression during vertebrate development. In chick embryos, segmentation of a new pair of somites occurs every 90 minutes and involves a mesenchyme-to-epithelium transition of cells from the presomitic mesoderm. Little is known about the cellular rearrangements involved, and, although it is known that the fibronectin extracellular matrix is required, its actual role remains elusive. Using 3D and 4D imaging of somite formation we discovered that somitogenesis consists of a complex choreography of individual cell movements. Epithelialization starts medially with the formation of a transient epithelium of cuboidal cells, followed by cell elongation and reorganization into a pseudostratified epithelium of spindle-shaped epitheloid cells. Mesenchymal cells are then recruited to this medial epithelium through accretion, a phenomenon that spreads to all sides, except the lateral side of the forming somite, which epithelializes by cell elongation and intercalation. Surprisingly, an important contribution to the somite epithelium also comes from the continuous egression of mesenchymal cells from the core into the epithelium via its apical side. Inhibition of fibronectin matrix assembly first slows down the rate, and then halts somite formation, without affecting pseudopodial activity or cell body movements. Rather, cell elongation, centripetal alignment, N-cadherin polarization and egression are impaired, showing that the fibronectin matrix plays a role in polarizing and guiding the exploratory behavior of somitic cells. To our knowledge, this is the first 4D in vivo recording of a full mesenchyme-to-epithelium transition. This approach brought new insights into this event and highlighted the importance of the extracellular matrix as a guiding cue during morphogenesis

α5β1 Integrin-Mediated Adhesion to Fibronectin Is Required for Axis Elongation and Somitogenesis in Mice

The arginine-glycine-aspartate (RGD) motif in fibronectin (FN) represents the major binding site for α5β1 and αvβ3 integrins. Mice lacking a functional RGD motif in FN (FNRGE/RGE) or α5 integrin develop identical phenotypes characterized by embryonic lethality and a severely shortened posterior trunk with kinked neural tubes. Here we show that the FNRGE/RGE embryos arrest both segmentation and axis elongation. The arrest is evident at about E9.0, corresponding to a stage when gastrulation ceases and the tail bud-derived presomitic mesoderm (PSM) induces α5 integrin expression and assumes axis elongation. At this stage cells of the posterior part of the PSM in wild type embryos are tightly coordinated, express somitic oscillator and cyclic genes required for segmentation, and form a tapered tail bud that extends caudally. In contrast, the posterior PSM cells in FNRGE/RGE embryos lost their tight associations, formed a blunt tail bud unable to extend the body axis, failed to induce the synchronised expression of Notch1 and cyclic genes and cease the formation of new somites. Mechanistically, the interaction of PSM cells with the RGD motif of FN is required for dynamic formation of lamellipodia allowing motility and cell-cell contact formation, as these processes fail when wild type PSM cells are seeded into a FN matrix derived from FNRGE/RGE fibroblasts. Thus, α5β1-mediated adhesion to FN in the PSM regulates the dynamics of membrane protrusions and cell-to-cell communication essential for elongation and segmentation of the body axis

From Dynamic Expression Patterns to Boundary Formation in the Presomitic Mesoderm

The segmentation of the vertebrate body is laid down during early embryogenesis. The formation of signaling gradients, the periodic expression of genes of the Notch-, Fgf- and Wnt-pathways and their interplay in the unsegmented presomitic mesoderm (PSM) precedes the rhythmic budding of nascent somites at its anterior end, which later develops into epithelialized structures, the somites. Although many in silico models describing partial aspects of somitogenesis already exist, simulations of a complete causal chain from gene expression in the growth zone via the interaction of multiple cells to segmentation are rare. Here, we present an enhanced gene regulatory network (GRN) for mice in a simulation program that models the growing PSM by many virtual cells and integrates WNT3A and FGF8 gradient formation, periodic gene expression and Delta/Notch signaling. Assuming Hes7 as core of the somitogenesis clock and LFNG as modulator, we postulate a negative feedback of HES7 on Dll1 leading to an oscillating Dll1 expression as seen in vivo. Furthermore, we are able to simulate the experimentally observed wave of activated NOTCH (NICD) as a result of the interactions in the GRN. We esteem our model as robust for a wide range of parameter values with the Hes7 mRNA and protein decays exerting a strong influence on the core oscillator. Moreover, our model predicts interference between Hes1 and HES7 oscillators when their intrinsic frequencies differ. In conclusion, we have built a comprehensive model of somitogenesis with HES7 as core oscillator that is able to reproduce many experimentally observed data in mice

Imigração e tuberculose. Experiência de cinco anos*

RESUMO: Os imigrantes constituem uma das populações de risco acrescido para a tuberculose. Em Portugal, em 2000, tiveram uma taxa de incidência para a tuberculose 3,6 vezes superior à da população em geral e, na sua maioria, eram oriundos de Angola e Cabo Verde.Encontrando-se o Centro de Diagnóstico Pneumológico da Venda Nova localizado numa zona de bairros degradados do distrito de Lisboa, prioritariamente constituidos por imigrantes das antigas colónias portuguesas em África, decidimos fazer uma avaliação retrospectiva dos casos de tuberculose neste grupo populacional, entre 1996 e 2000, comparando os dados obtidos com alguns dados da tuberculose nos não imigrantes também do nosso Serviço, no mesmo período em estudo.A tuberculose nos imigrantes corresponde a 24,5 % do número total de casos, 71,4 % do sexo masculino e 93,9 % da raça negra e naturais, principalmente, de Cabo Verde e Angola. 73% residiam em Portugal há mais de 5 anos, 86,7 % eram casos novos e 13,3 % retratamentos. 174 eram tuberculoses pulmonares, 70,7 % D+ e 81 % confirmadas (contra 75 % nos não imigrantes).Dos 91 antibiogramas realizados nas tuberculoses pulmonares destes imigrantes, 9,9 % detectaram multirresistência, contra 5 % nos não imigrantes.Vinte e seis vírgula seis por cento eram portadores de SIDA, contra 18 % nos restantes doentes.Algumas conclusões: percentagem importante de imigrantes com tuberculose no Centro de Diagnóstico Pneumológico da Venda Nova; maior confirmação da tuberculose pulmonar, mais multirresistência e mais casos de SIDA, nos imigrantes.REV PORT PNEUMOL 2003; IX (3): 195-204 ABSTRACT: Immigrants are a tuberculosis risk group. In Portugal, in 2000, they had an incidence rate 3.6 times higher then the global incidence, and were native, predominantly, from Angola and Cabo Verde.Being the Chest Disease Center of Venda Nova located in a residencial area with a great number of immigrants, most of them living in slumms, we decided to evaluate the tuberculosis cases in this group, between 1996/2000, comparing the data obtained with some data of the tuberculosis cases in the non-immigrants.Immigrants with tuberculosis corresponded to 24.5 % of all cases, 71.4 % male, 93.9 % black and mostly native from Cabo Verde and Angola. 73 % lived in Portugal for more then 5 years, 86.7 % were new cases and 13.3 % relapses. 174 were pulmonary forms, 70.7 % of wich were D+ and 81 % confirmed (against 75 % in the non-immigrants).Of the 91 drug susceptibility tests done in the pulmonary forms, 9.9 % revealed multidrug resistence, against 5 % in the non-immigrants.Twenty six point six percent had AIDS against 18 % in the non-immigrants.Some conclusions: important percentage of immigrants with tuberculosis in the Chest Disease Center of Venda Nova; immigrants have a higher confirmation rate of pulmonary tuberculosis, more multidrug resistance and AIDS cases.REV PORT PNEUMOL 2003; IX (3): 195-204 Palavras-chave: tuberculose, imigrantes, Key-words: tuberculosis, immigrant

Rastreio de conviventes. Análise da actuação de um Serviço de Tuberculose e Doenças Respiratórias (S.T.D.R.)** Trabalho apresentado, parcialmenmte, como comunicação, no 1a Congresso de Pneumologia do Norte, em 1994

RESUMO: A tuberculose continua a ser, em Portugal, um importante problema de Saúde Pública, com uma incidência de 55.8/100.000 habitantes, em 1991.Sendo os doentes baciliferos a principal fonte de contágio, os nossos esforços são sempre centralizados no diagnóstico precoce e tratamento efectivo dos mesmos.Os seus conviventes são um grupo de alto risco pelo que a nossa actividade preventiva deve incidir, preferencialmente, sobre eles.Os autores propuseram-se avaliar a rentabilidade e eficáicia das medidas tomadas no rastreio dos conviventes dos casos de tuberculose pulmonar admitidos entre Julho de 1992 e Junho de 1993. Neste período, foram classificados 275 doentes como tuberculose, 152 (55.3%) dos quais com tuberculose pulmonar.A taxa de confirmação foi de 84.2%. Identificámos 441 contactos (3.3/caso índice), correspondendo a 131 casos índice. Compareceram ao rastreio 345 (78.2%), sendo o tempo médio decorrido entre a consulta do caso índice e o rastreio dos conviventes de 18.3 dias.Diagnosticámos tuberculose pulmonar em 9 conviventes (2.6%) e tuberculose infecção em 33 (9.6%).Discutimos mais pormenorizadamente os resultados encontrados e concluimos, entre outras, que houve uma boa adesão dos conviventes ao rastreio, da sua importância na detecção da tuberculose doença e infecção e da necessidade de se prolongar a vigilância dos contactos. SUMMARY: In Portugal, tuberculose (TB) remains a serious health problem, with an incidence rate of 55.8 in 1991.As the risk of transmission is mainly from the sputum positive TB cases, our efforts have to be directed towards an early diagnosis and a correct treatment of those cases.Contacts, as a group, are at a high risk. They are the most important on wich to focus preventive intervention.Working the authors in a Tuberculosis Unit in the Lisbon District, they proposed to evaluate their effectiveness on contacts investigation of pulmonary tuberculosis cases admitted between July 1992 and June 1993. In this period, 275 patients with TB were admited, 152 (55.3%) with pulmonary tuberculosis. The confirmation rate was of 84.2% of 131 index cases, we identified 441 contacts (3.3 contacts/index case).Three hundred and forty five attended the investigation (78.2%). The mean time elapsed between consultation of the index case and the investigation of the contacts was of 18.3 days.Tuberculosis disease was diagnosed in 9 contacts (2.6%,) and tuberculosis infection in 33 (9.6%.).The results of both situations are discussed in detail. As conclusions, among others, we can say there was a good participation of the contacts, the importance of their investigation in the detection of tuberculosis disease and infection and the need to prolong the surveilance of the contacts. Palavras-chave: tuberculose, rastreio de conviventes, Key-words: tuberculosis, contacts investigatio

Modelling human rostro-caudal neural patterning with a microfluidic morphogenic gradient

The study of biological mechanisms involved in human fetal brain development requires suitable models. To date, most findings have been acquired from animal models that fail to account for human-specific developmental traits. To counteract this limitation, a novel in vitro model is proposed where human pluripotent stem cells are differentiated into a coherent fetal brain tissue in a gradient forming microfluidic system. Stainings show that the model can be used to investigate the patterning, an important developmental event, of stem cells into forebrain, midbrain and hindbrain. In conclusion, this model could provide a new platform for studying human-specific brain development