Identification of a novel human polyomavirus in organs of the gastrointestinal tract

Peer reviewedPublisher PD

Untersuchungen zur genetischen und serologischen Prävalenz eines neuen humanen Polyomavirus

Polyomaviren sind weltweit verbreitet und wurden bei einer Vielzahl von Tierarten sowie beim Men-schen nachgewiesen. Durch Anwendung der PCR und anderer Nukleinsäure-basierter Nachweisverfah-ren wurden bis heute neun humane Polyomaviren identifiziert. Diese Entdeckung neuer humaner Polyomaviren, insbesondere in den letzten Jahren, wirft die Frage nach den Auswirkungen von Polyomavirus-Infektionen beim Menschen auf. Im Februar 2011 wurde am Robert-Koch-Institut in der Arbeitsgruppe von Dr. Bernhard Ehlers ein neu-es humanes Polyomavirus entdeckt, welches die vorläufige, bisher unpublizierte Bezeichnung „Huma-nes Polyomavirus 10 (HPyV10)“ erhielt. Das gesamte Genom des Virus wurde bereits vollständig sequenziert und der VP1-kodierende Leserahmen identifiziert. Derzeit liegen noch keine Informationen über ein pathogenes Potential dieses Virus vor. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Seroepidemiologie des HPyV10 untersucht. Hierzu wur-den Seren von gesunden erwachsenen Blutspendern und Kindern auf das Vorhandensein von spezifi-schen IgG mit Reaktivität gegen HPyV10 getestet. Positive Befunde wurden als Hinweis auf eine durchgemachte oder bestehende Infektion gewertet. Desweiteren wurden DNA-Extrakte aus humanen Organen auf die Präsenz von Nukleinsäuren des HPyV10 untersucht. Zur Untersuchung der Seroepidemiologie des HPyV10 wurde ein Kapsomer-basierter ELISA entwi-ckelt, welcher gegen das VP1-Kapsidprotein des HPyV10 gerichtete IgG im Humanserum detektiert. Als Positiv- bzw. Negativkontrolle im ELISA wurden das VP1-Protein des humanen BK-Polyomavirus (BKPyV) und des aviären Budgerigar Fledgling Disease Virus (BFDPyV) mitgeführt. Die Häufigkeit der Seroreaktivität gegen HPyV10-VP1 bei gesunden Blutspendern (n=297) ergab eine Prävalenz von 23,6%. Die höchste Seroprävalenz mit 33% sowie die höchste Seroreaktivität gegen HPyV10 mit OD450=0,4 (durchschnittliche Seroreaktivität: OD450=0,21) wurden in der Altersklasse der 51 bis 60-Jährigen nachgewiesen. In 17,2% der untersuchten Kinderseren (n=99) wurden ebenfalls IgG mit Spezi-fität gegen HPyV10 detektiert. Diese Ergebnisse zeigen einerseits, dass die Infektion mit HPyV10 schon im Kindesalter erfolgt und andererseits, dass auch gesunde Erwachsene infiziert sind – ähnlich wie bei den bereits bekannten humanen Polyomaviren. Eine Geschlechtspräferenz für HPyV10-Infektionen konnte nicht festgestellt werden. Für den Nachweis von Genomkopien des HPyV10 wurde eine spezifische RT-PCR entwickelt, welche die Amplifikation von 139 bp-großen Produkten des Virus und deren Quantifizierung bis zu einer Kopienzahl von n=5 ermöglicht. Nach Optimierung der Parameter, welche Einfluss auf die Signalintensität nehmen, wurde eine Primerkonzentration von 400 nM, eine Sondenkonzentration von 150 nM, eine MgCl2-Konzentration von 6 mM und einer Annealingtemperatur von 59°C für die Amplifikation der HPyV10-DNA verwendet. Im Anschluss wurden mit dieser RT-PCR Leber- (n=80), Lymphknoten- (n=19) und Milzproben (n=11) von Organtransplantierten und Tumorpatienten getestet. Fünf der Leberproben waren bereits durch die frühere Anwendung konventioneller PCR-Techniken als HPyV10-positiv charakterisiert worden. Mit der hochsensitiven RT-PCR konnten in diesen fünf Proben sowie in acht zusätzlichen Leberproben zwi-schen bis zu 133 Genomkopien des HPyV10 detektiert werden. In den Lymphknoten- und Milzproben war der Nachweis negativ. In den vorliegenden Untersuchungen wurde gefunden, dass gesunde Blutspender eine Seroreaktivität gegen HPyV10 besitzen. Gegenstand weiterer Forschung könnte nun sein, Seren immungeschwächter Personen auf die Häufigkeit und Stärke spezifischer serologischer Reaktionen gegen HPyV10 zu unter-suchen und damit Hinweise auf eine mögliche Pathogenität des Virus zu erhalten. Außerdem könnten zukünftig weitere ausgewählte Patientengruppen mit Hilfe der RT-PCR auf Präsenz des HPyV10 getes-tet werden, um Hinweise auf einen möglichen Krankheitswert zu erhalten. Falls dem HPyV10 pathoge-ne Eigenschaften zugeordnet werden können, wird die weitere Charakterisierung des HPyV10 ein Mei-lenstein auf dem Weg zur Entwicklung einer gezielten Infektionsprophylaxe und Therapie sein

Detection of HPyV12 with PCR.

a<p>Samples collected for BKPyV infection diagnosis.</p>b<p>From patients under natalizumab (Tysabri) therapy.</p>c<p>Samples collected for herpesvirus infection diagnosis.</p>d<p>Samples collected for JCPyV infection diagnosis.</p>e<p>Combined results of specific nested PCR and real-time PCR; samples were considered as positive if the result could be independently reproduced on different days.</p

Phylogenetic analysis of HPyV12.

<p>A Bayesian chronogram was deduced from the analysis of a 488 amino acid alignment of LTAg sequences. Polyomaviruses identified from human hosts are in red, from apes in blue. The human polyomaviruses MXPyV and the US strain of MWPyV have the same phylogenetic position as HPyV10 and are not shown. The sequence of the very recently discovered human STLPyV which is most closely related to HPyV10, MWPyV and MXPyV, became only available at the end of the revision process of this manuscript; it was therefore not included in the datasets put together for the present study. Statistical support for branches is given as posterior probability/bootstrap. For three branches defining potentially meaningful bipartitions (with respect to the question of the phylogenetic placement of HPyV12), statistical support observed for the corresponding bipartitions in the VP2 and VP1 analyses is also shown (grey panels). Hyphen indicates that bipartition was not observed in the ML or Bayesian tree. The scale axis is in amino acid substitution per site. This chronogram was rooted using a relaxed clock. A maximum likelihood analysis of the same dataset concluded to a similar topology and is thus not shown here.</p

Detection of polyomaviruses in gastrointestinal and lymphoid organs with generic PCR.

a<p>Detected with generic PCR.</p

Genome organization of HPyV12.

<p>Putative coding regions for VP1 to VP3, STAg antigen, and LTAg antigen are marked by arrows.</p

Reactivity of human sera to VP1 of HPyV12.

<p>The percentage of seroreactivity of pediatric sera (n = 74; 2–11 years) and sera of healthy adolescents and adults (n = 299; age: 16–72 years) in ELISA is shown. The results were stratified by age.</p