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Editorial: Roots—the hidden provider
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Voltage-sensor transitions of the inward-rectifying K+ channel KAT1 indicate a latching mechanism biased by hydration within the voltage sensor
The Kv-like K+ channels at the plasma membrane, including the inward-rectifying KAT1 K+ channel of Arabidopsis, are important targets for manipulating K+ homeostasis in plants. Gating modification, especially, has been identified as a promising means by which to engineer plants with improved characteristics in mineral and water use. Understanding plant K+ channel gating poses several challenges, despite many similarities to that of mammalian Kv and Shaker channel models. We have used site-mutagenesis to explore residues that are thought to form two electrostatic counter-charge centers either side of a conserved Phe residue within the S2 and S3 α-helices of the voltage sensor domain (VSD) of Kv channels. Consistent with molecular dynamic simulations of KAT1, we show that the voltage dependence of the channel gate is highly sensitive to manipulations affecting these residues. Mutations of the central Phe residue favored the closed KAT1 channel, whereas mutations affecting the counter-charge centers favored the open channel. Modelling of the macroscopic current kinetics also highlighted a substantial difference between the two sets of mutations. We interpret these findings in context of the effects on hydration of amino-acid residues within the VSD and with an inherent bias of the VSD, when hydrated around a central Phe residue, to the closed state of the channel
Búsqueda de variaciones en el número de copias y la secuencia de nucleótidos de los canales iónicos presentes en los cetáceos en su transición de vida terrestre a la acuática
47 p.Los cetáceos son un infraorden acuático perteneciente a los mamíferos, se calcula que alrededor de 50 millones de años atrás estos evolucionaron desde un animal terrestre. Este ancestro terrestre inmediato comenzó a evolucionar al cambiar sus hábitos ingresando al agua por la necesidad de alimento y para escapar de sus depredadores. Los cambios más notorios son los físicos donde las extremidades traseras disminuyeron a un tamaño prácticamente imperceptible y por ejemplo sus orificios nasales migraron hacia su espalda. La transición de la vida terrestre a la acuática supone diversos cambios necesarios para la supervivencia que son interesantes de estudiar, cambios en rasgos genéticos como la pérdida o la selección positiva de genes, los cambios en la expresión de proteínas, su estructura y funcionamiento son temas que generan interrogantes y con los datos y herramientas actuales es posible analizarlas y responderlas. Al mencionar proteínas hay muchas que son estudiadas con diversas funciones fundamentales, una de las categorías de proteínas más estudiadas a lo largo de los años es la de los canales iónicos. Los canales iónicos permiten el paso de iones a través de la membrana para mantener un equilibrio entre el exterior e interior de la célula, en este caso se estudiarán ya que los cetáceos tuvieron un cambio de hábitat y por lo tanto de las sustancias presentes en el medio circundante como el oxígeno y los iones. Estos canales provocan el potencial de acción que permite al organismo realizar acciones fundamentales como pensar, el latido del corazón y la excitación muscular entre muchas otras. El objetivo de este trabajo es estudiar cómo varió el número de canales presentes en los cetáceos en su transición de la tierra al agua y si la secuencia proteica de los canales iónicos sufrió cambios debido a las adaptaciones a las que debieron someterse estos mamíferos. Esta variación tanto en la secuencia como en el número de copias representaría un cambio en la necesidad de canales iónicos de los cetáceos para mantener la homeostasis en su adaptación a la vida acuática. La metodología utilizada incluye diversas herramientas computacionales con diferentes propósitos. Para la identificación de canales se utiliza Tmhmm2.0 y RPS-BLAST. Para análisis más específicos como la identificación de genes ortólogos se usó OMA y para las variaciones de secuencia y familia de proteínas se usó PAML y CAFÉ respectivamente. Los organismos estudiados son varios cetáceos como la Beluga, el delfín chino de río, la Orca, entre otros
Induciendo eventos de disociación en complejos proteína-proteína
59 p.Los eventos de asociación o binding de complejos proteína-proteína han sido y son ampliamente estudiados lo que, en parte, refleja la relevancia de este tipo de
sucesos en procesos y funciones vitales a nivel celular. A pesar de lo anterior, las
investigaciones sobre eventos de disociación o unbinding de complejos proteínaproteína,
de tanta relevancia biológica como su asociación, son escasas. Esto no ocurre debido a la falta de interés que podría existir referente a estos eventos, más bien es consecuencia de la dificultad intrínseca de estudiar la disociación de sistemas tan grandes como los complejos proteína-proteína; son sucesos que ocurren en el orden de los microsegundos e incluso años. El alto costo
computacional que genera el análisis in silico de complejos proteína-proteína ha
dejado al descubierto la necesidad de plantear y/o utilizar métodos no
convencionales de dinámica molecular para su estudio como, por ejemplo, el uso de ligandos más pequeños como drogas o toxinas. En particular, caribdotoxina (CTX) corresponde a una toxina de origen peptídico sintetizada por Leiurus quinquestriatus hebraeus, que tiene como blanco molecular canales de potasio (de importante rol en la excitabilidad del sistema nervioso) provocando la oclusión del poro de estos canales. A su vez, esta propiedad ha sido ampliamente utilizada para modelar y estudiar canales de potasio dependientes de voltaje. Rica en residuos alcalinos, CTX ocluye el poro del canal mediante interacciones
electrostáticas atractivas con residuos que se ubican en la porción extracelular de la proteína de membrana. Se ha determinado además, que su acción es dependiente tanto del voltaje como de la concentración interna y externa de K+. Sumado a lo anterior, se ha propuesto un modelo de interacción “simple”:
Shaker/CTX, considerado como tal, ya que, su acople no conduce a cambios conformacionales ni encaje inducido y, por ende, a partir del análisis de las superficies de interacción entre ambos sería posible modelar fenómenos de disociación. En consecuencia, se propone para este trabajo, realizar análisis de
eventos de disociación proteína-proteína inducidos por la aplicación de potencial
eléctrico, con tal de observar y cuantificar los estados de transición que anteceden
a los eventos de disociación y la contribución energética de cada uno de los pares interactuantes en la interfaz del complejo toxina-canal, mediante el sistema
Shaker/CTX. // ABSTRACT: The association or binding events of protein-protein complexes have been
extensively studied, which, in part, reflects the relevance of this type of events in
vital processes and functions at the cellular level. Despite the above, research on
the dissociation or unbinding events of protein-protein complexes, of as much
biological relevance as their association, is limited. This is not due to a lack of
interest in these events, but to the intrinsic difficulty of studying the dissociation of
systems as large as protein-protein complexes; these are events that occur in the
order of microseconds or even years. The high computational cost of in silico
analysis of protein-protein complexes has revealed the need to develop and/or use
unconventional molecular dynamics methods for their study, for example, the use
of smaller ligands such as drugs or toxins. In particular, charybdotoxin (CTX)
corresponds to a toxin of peptide origin synthesized by Leiurus quinquestriatus
hebraeus, which has as its molecular target the potassium channels (of important
role in the excitability of the nervous system) causing the occlusion of the pore of
these channels. This property has been widely used to model and study voltagedependent
potassium channels. Rich in alkaline residues, CTX occludes the
channel pore through attractive electrostatic interactions with residues located in
the extracellular portion of the membrane protein. It has also been determined that
its action is dependent on both voltage and internal and external K+ concentration.
In addition to the above, a "simple" interaction model has been proposed:
Shaker/CTX, because their coupling does not lead to conformational changes or
induced binding and, therefore, from the analysis of the interaction surfaces
between the two it would be possible to model dissociation phenomena.
Consequently, it is proposed for this work to analyze the protein-protein
dissociation events induced by the application of electric potential, in order to
observe and quantify the transition states that precede the dissociation events and
the energetic contribution of each of the interacting pairs at the interface of the
toxin-channel complex, by means of the Shaker/CTX system
Caracterización estructural de matrices peptídicas con aplicaciones en regeneración de tejido biológico
62 p.Los biomateriales son compuestos sintéticos diseñados para interactuar con
sistemas biológicos y que, junto a la ingeniería de tejidos, han generado una gran
revolución en el campo biomédico. Enfocados en la medicina regenerativa, se ha
demostrado que algunos péptidos similares al colágeno (CLP) al estar
funcionalizando y protegiendo nanopartículas metálicas, han logrado regenerar
tejido biológico de piel, cornea e incluso tejidos tan complejos como el de corazón.
Más en detalle, se ha propuesto que los CLP permitirían la comunicación del
nanomaterial a la matriz extracelular (EMC), la cual está formada de redes macrobiomoleculares
tridimensionales y proteínas de comunicación extracelular tales
como las Integrinas. Por otro lado, los CLPs han sido destacados por su unión
selectiva a integrinas por medio de motivos conocidos (GFOGER, RGD). Sumado
a esta gran red de elementos que conforman la matriz extracelular, el
polietilenglicol (PEG) es un poliéter muy utilizado en la funcionalización de
nanomateriales y posee características químicas que lo hacen candidato directo
para la creación de hidrogeles basados en nanopartículas poliméricas. Por ende,
el uso de PEG podría otorgar cualidades de señalización celular específica a
nanopartículas, como lo son las terapias contra el cáncer. Sin embargo, poco se
conoce respecto a la organización estructural de esta matriz sintética extracelular,
como tampoco el efecto estabilizador que a nivel macroscópico otorga la
utilización de PEG en conjunto con CLP. En este ámbito, se ha postulado que el
uso de matrices sintéticas y bio-funcionales sería clave para la estabilización de la
ECM. Adicionalmente, el conocer detalles estructurales del autoensamblado de
estas matrices extracelulares permitiría comprender los mecanismos de
ordenamiento, así como también las interacciones moleculares involucradas en la
estabilización, que le confieren propiedades macromoleculares de interés para el
diseño y optimización de este tipo de materiales. En base a lo expuesto, en este proyecto se propone realizar un estudio del orden tridimensional adquirido luego
del proceso de autoensamblado de una matriz peptídica, y con ello orientar al
futuro desarrollo de biomateriales sintéticos con aplicaciones en regeneración de
tejido biológico. Para ello, se utilizará un set de herramientas computacionales
tales como simulación molecular con y sin presencia de solvente, así como
también análisis masivos mediante VMD para poder estudiarlos en tiempos a
nanoescala. // ABSTRACT: Biomaterials are synthetic compounds designed to interact with biological systems,
which, together with tissue engineering, have generated a great revolution in the
biomedical field. Focusing on regenerative medicine, several studies have shown
that collagen-like peptides (CLP), by functionalizing and protecting metallic
nanoparticles, have managed to regenerate biological tissue of the skin, cornea,
and even tissues as complex as the heart. In detail, it has been proposed that
CLPs would allow the communication of the nanomaterial to the extracellular
matrix (ECM), which is made up of three-dimensional macro-biomolecular
networks and extracellular communication proteins such as integrins. On the other
hand, CLPs have been highlighted for their selective binding to integrins through
known motifs like GFOGER and RGD. In addition to this large network of elements
that make up the extracellular matrix, polyethylene glycol (PEG) is a polyether
widely used in the functionalization of nanomaterials. Furthermore, its chemical
characteristics make it a direct candidate for creating hydrogels based on
polymeric nanoparticles. Therefore, PEG could provide specific cell signaling
qualities to nanoparticles, such as cancer therapies. However, there is por
knowledge about the structural organization of this synthetic extracellular matrix
nor the stabilizing effect that the use of PEG in conjunction with CLP provides at a
macroscopic level. In this field, it has been postulated synthetic and bio-functional
matrices would be the key to stabilizing the ECM. Additionally, knowing the
structural details of the self-assembly of this extracellular matrix would allow us to
understand the ordering mechanisms, and the molecular interactions involved in
stabilization, which confer macromolecular properties of interest for the design and
optimization of this type of materials. Based on the above, this project proposes to
study the threedimensional order acquired after the self-assembly process of
peptide matrix and thereby guide the future development of synthetic biomaterials
with applications in biological tissue regeneration. For this, a set of computational tools will be used, such as molecular simulation, with and without the presence of a solvent, along with massive analysis through VMD to study them in nanoscale times
Relación entre número de exonizaciones de elementos transponibles y metilaciones CpG del Reloj epigenético de Horvath
96 p.El envejecimiento es un conjunto de cambios fisiológicos y morfológicos en un
organismo, que se acumulan con el paso del tiempo, y generan un deterioro
progresivo de las funciones biológicas, por ejemplo, la reducción de fuerza
muscular y otros aspectos cognitivos. Existen al menos una decena de teorías que
tratan de explicar el envejecimiento, las cuales se clasifican en tres grupos: teorías
programadas, teorías de acumulación de daño y teorías combinadas. Las teorías
de envejecimiento se basan principalmente en alteraciones que impactan a la
cromatina mediante marcas epigenéticas, como son las metilaciones de ADN
(ADNm), las cuales, en su mayoría disminuyen durante el envejecimiento. Estas
marcas son las únicas que afectan directamente al ADN, suprimiendo la expresión
y movimiento de elementos transponibles (TEs), y ocurren preferentemente en
posiciones específicas del genoma llamadas islas CpG. Las ADNm fueron
utilizadas por Horvath para el desarrollo de su reloj epigenético, basado en teorías
combinadas del envejecimiento, especialmente en la de pérdida de
heterocromatina, el cual es un modelo predictor de la edad cronológica, que
analiza el grado de metilación de islas CpG específicas en múltiples tejidos
humanos. Los sectores del genoma que son ricos islas CpG, susceptibles a la
ADNm son, entre otras, las regiones de TEs adyacentes a genes, los cuales son
importantes debido a que los TEs se encuentran extensamente repetidos en el
genoma, y a pesar de que son insertados mayoritariamente en zonas no
codificantes, pueden formar parte de nuevos exones (exonizaciones) gracias al
splicing alternativo. Las exonizaciones de TEs pueden aumentar en número si las
marcas del tipo ADNm disminuyen. Aún no se ha demostrado que pueda existir
una relación entre las exonizaciones de TEs y las ADNm que son analizadas por Horvath. Pero, si se logra demostrar que existe un aumento de exonizaciones de TEs durante el envejecimiento, y éstas se ven afectadas por ADNm de islas CpG
de Horvath, se podrían relacionar a las exonizaciones de TEs con las islas CpG de
Horvath. Debido a esto, nace la pregunta: “¿Existe relación entre el número de
exonizaciones de TEs y las metilaciones de Horvath?”. El presente trabajo,
pretende recoger evidencia que apoye la idea de que existe un número creciente
de exonizaciones de TEs durante el envejecimiento, y que dicho número podría
estar relacionado con el grado de metilación de las islas CpG analizadas en el
reloj de Horvath. Se utilizan muestras sanas, de fastq y ADNm, de tejidos de
rombencéfalo (cerebelo, bulbo raquídeo y puente de Varolio) humano en distintas
edades, desde las 4 semanas de gestación a los 58 años. El número de
exonizaciones de TEs de cada muestra (fastq) se obtiene a partir de herramientas
bioinformáticas, principalmente Tophat. Las islas CpG se obtienen desde la
investigación de Horvath. La información es analizada con respecto a la edad real
de las muestras, y se espera encontrar correlación entre el número de exonizaciones de TEs y las islas CpG usadas por Horvath. // ABSTRACT: Aging is a set of physiological and morphological changes in an organism, which
accumulate with the lenght of time and generate a progressive deterioration of
biological functions, for example, the reduction of muscle strength and other
cognitive aspects. There are at least a dozen theories that try to explain aging,
which are classified into three groups: programmed theories, damage
accumulation theories and combined theories. Aging theories are mainly based on
alterations that impact chromatin through epigenetic marks, such as DNA
methylations (mDNA), which mostly decrease during aging. These marks are the
only ones that directly affect DNA, suppressing the expression and movement of
transposable elements (TEs), and occur preferentially in specific positions of the
genome called CpG islands. mDNAs were used by Horvath for the development of
his epigenetic clock, based on combinatorial theories of aging, especially
heterochromatin loss, which is a model predictor of chronological age that analyzes
the degree of methylation of specific CpG islands in multiple human tissues.
Sectors of the genome that are rich in CpG islands, susceptible to mRNA are,
among others, TE regions adjacent to genes, which are important because TEs are
found extensively repeated in the genome, and although they are mostly inserted
in non-coding regions, they can form part of new exons (exonizations) by means of
alternative splicing. Exonizations of TEs can increase in number if mRNA-like
marks decrease. It has not yet been demonstrated that there could be a
relationship between TE exonizations and the mRNAs that are analyzed by
Horvath. But, if it can be shown that there is an increase in TE exonizations during
aging, and these are affected by Horvath CpG island mRNAs, then TE
exonizations could be related to Horvath CpG islands. Because of this, the
question arises, "Is there a relationship between the number of TE exonizations
and Horvath methylations?". The present work aims to gather evidence to support
the idea that there is an increasing number of TE exonizations during aging, and
that this number could be related to the degree of methylation of the CpG islands
analyzed in the Horvath clock. Healthy fastq and mDNA samples from human hindbrain tissues (cerebellum, medulla oblongata and pons) at different ages, from
4 weeks of gestation to 58 years old, are used. The number of TEs exonizations of
each sample (fastq) is obtained from bioinformatics tools, mainly Tophat. The CpG
islands are obtained from Horvath research. The information is analyzed with
respect to the actual age of the samples, and it is expected to find correlation between the number of TEs exonizations and the CpG islands used by Horvath
K-2P channels in plants and animals
Two-pore domain potassium (K2P) channels are membrane proteins widely identified in mammals, plants, and other organisms. A functional channel is a dimer with each subunit comprising two pore-forming loops and four transmembrane domains. The genome of the model plant Arabidopsis thaliana harbors five genes coding for K2P channels. Homologs of Arabidopsis K2P channels have been found in all higher plants sequenced so far. As with the K2P channels in mammals, plant K2P channels are targets of external and internal stimuli, which fine-tune the electrical properties of the membrane for specialized transport and/or signaling tasks. Plant K2P channels are modulated by signaling molecules such as intracellular H+ and calcium and physical factors like temperature and pressure. In this review, we ask the following: What are the similarities and differences between K2P channels in plants and animals in terms of their physiology? What is the nature of the last common ancestor (LCA) of these two groups of proteins? To answer these questions, we present physiological, structural, and phylogenetic evidence that discards the hypothesis proposing that the duplication and fusion that gave rise to the K2P channels occurred in a prokaryote LCA. Conversely, we argue that the K2P LCA was most likely a eukaryote organism. Consideration of plant and animal K2P channels in the same study is novel and likely to stimulate further exchange of ideas between students of these fields
Die Ueberforderung des Staates
SIGLEUuStB Koeln(38)-871101260 / FIZ - Fachinformationszzentrum Karlsruhe / TIB - Technische InformationsbibliothekDEGerman
Generación de mutantes de los residuos D308 y D310 del motivo DTD del transportador de sacarosa StSUT1para investigar posibles sensores de pH.
53 p.El azúcar más importante en el metabolismo de los hidratos de carbono de las
plantas es la sacarosa, que se encuentra en todas las plantas vasculares superiores. Este metabolito no se genera directamente de la fotosíntesis. Después de producirse los azúcares de tres carbonos en la fotosíntesis, estos azúcares son convertidos en hexosas
como glucosa y fructosa en donde posteriormente estos monosacáridos son convertidos en disacáridos como la sacarosa y deben ser transportados a otras partes de la planta para usarse en el metabolismo. El movimiento de la sacarosa a corta y larga distancia en las plantas está íntimamente relacionado con la actividad de las proteínas
transportadoras de sacarosa. Tanto la entrada de la sacarosa al floema en la fuente (denominada carga del floema) como la salida del floema hacia los sumideros (descarga del floema) pueden ocurrir por dos vías: simplástica y apoplástica. En todos los casos en que la sacarosa salga al apoplasto esta debe ser incorporada de nuevo al simplasto por una proteína transportadora (SUT o SUC, SUcrose Transporter o Carrier). En este
estudio se trabajó con el transportador de sacarosa SUT1 de Solanum tuberosum (papa)
StSUT1. Se sabe según estudios anteriores realizados en levadura que en mutantes dobles del motivo DTD del transportador de sacarosa StSUT1 la capacidad de detectar el pH está afectada. Estos estudios solo fueron realizados en mutantes dobles pero todavía no se sabe cuál es la contribución individual de los residuos D308 y D310. La mutagénesis dirigida al sitio D308 y D310 del motivo DTD del transportador de sacarosa StSUT1 proporciona información sobre los aminoácidos funcionales, que son altamente conservados y responsables de este aumento extraordinario en la capacidad de transporte bajo condiciones de pH extremos. Este trabajo tiene por objetivo la generación de mutantes simples y cRNA en donde queremos investigar la contribución individual de cada aminoácido que estarían modificando la actividad del transportador de sacarosa StSUT1 según un posterior análisis del efecto del pH en la regulación de dicho transportador mediante
electrofisiología, ya que según evidencia experimental se sabe que la actividad de
transportador es en el rango de pH ácido. La generación de mutantes se realizó mediante técnicas de biología molecular por el método USER cloning para que la actividad del transportador se mida posteriormente mediante la técnica de electrofisiología