Recent progress in fluctuation theorems and free energy recovery

In this note we review recent progress about fluctuation relations and their applicability to free energy recovery in single molecule experiments. We underline the importance of the operational definition for the mechanical work and the non-invariance of fluctuation relations under Galilean transformations, both aspects currently amenable to experimental test. Finally we describe a generalization of the Crooks fluctuation relation useful to recover free energies of partially equilibrated states and thermodynamic branches.Comment: 15 pages, 8 figure

Design of a novel bioink suitable for the 3D printing of lymphoid cells

Introduction: For decades, in vitro 2D cell culture techniques have been employed in research, but they fail to recapitulate the complexity of natural tissues. 3D bioprinting could potentially overcome this drawback due to the possibility to control the spatial disposition of living cells and the geometry of the 3D scaffold. Materials and methods: This study reports the design and characterization of a novel bioink for extrusion bioprinting, analyzing different blend formulations composed of alginate, gelatin, and methylcellulose, suitable as cell-laden bioink for lymphoid cells, in particular those isolated from patients with Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). The rheological properties as a function of temperature and the printability of the formulations were investigated to define the optimal printing parameters. In vitro stability of the printed scaffolds was investigated under culture conditions and compression tests were performed on printed and bioprinted scaffolds to compare their mechanical properties with those of fresh lymphoid tissue. Finally,MEC1, aCLL cell line,was bioprinted to investigate cell viability, cell density, and cell capability to be released from the scaffold over time. Results and discussion: Results showed that, for the selected blends, good shape fidelity and printing accuracy were achieved with a limitation on the number of printed layers. Scaffolds withstood culture conditions showing stability for up to 3 weeks and their mechanical properties were similar to those of lymphoid tissues already reported in the literature. High cell viability after 21 days was observed for both MEC1 and primary peripheral mononuclear cells, confirming the possibility to use the selected formulation to successfully bioprint lymphoid cells by possibly mimicking their native lymphoid microenvironment

A Temperature-Jump Optical Trap for Single-Molecule Manipulation

[EN] To our knowledge, we have developed a novel temperature-jump optical tweezers setup that changes the temperature locally and rapidly. It uses a heating laser with a wavelength that is highly absorbed by water so it can cover a broad range of temperatures. This instrument can record several force-distance curves for one individual molecule at various temper- atures with good thermal and mechanical stability. Our design has features to reduce convection and baseline shifts, which have troubled previous heating-laser instruments. As proof of accuracy, we used the instrument to carry out DNA unzipping experi- ments in which we derived the average basepair free energy, entropy, and enthalpy of formation of the DNA duplex in a range of temperatures between 5 C and 50 C. We also used the instrument to characterize the temperature-dependent elasticity of single-stranded DNA (ssDNA), where we find a significant condensation plateau at low force and low temperature. Oddly, the persistence length of ssDNA measured at high force seems to increase with temperature, contrary to simple entropic models.The authors thank J. Camunas and S. Frutos for contributing the molecules used in the experiments, and J.M. Huguet for helpful discussion. F.R. is supported by grant Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats Academia 2013 and J.R. A.-G. by an Explora grant from MINECO (MAT2013-49455-EXP). The research that led to the results presented here was funded by the European Union Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under grant 308850 INFERNOS and European Research Council grant MagReps (No. 267862).De Lorenzo, S.; Ribezzi-Crivellari, M.; Arias-Gonzalez, JR.; Smith, S.; Ritort, F. (2015). A Temperature-Jump Optical Trap for Single-Molecule Manipulation. Biophysical Journal. 108(12):2854-2864. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.05.017S285428641081

A dual-trap optical tweezer setup for single molecule manipulation : development and testing

Tradizionalmente, gli esperimenti di chimica e biologia hanno coinvolto quantità macroscopiche di molecole (moli o grammi) della stessa specie. Questi esperimenti, che hanno contribuito a sviluppare i fondamenti della termodinamica e della meccanica statistica, provano le proprietà di un insieme di molecole, ed i risultati cosi' ottenuti rivelano i valori medi su tale insieme. A complemento di questi esperimenti, negli ultimi due decenni si sono sviluppati sistemi sperimentali per misurare le proprietà di un' unica molecola alla volta, ottenendo informazioni non mediate. Questa nuova classe di esperimenti permette, per esempio, di misurare direttamente le fluttuazioni conformazionali in un unico biopolimero o la distribuzione delle dimensioni dei passi di un motore molecolare [1]. Si e' anche data la possibilità di studiare il comportamento di queste molecole in condizioni di stress meccanico (Force Spectroscopy Tecniche, FST). Le pinze ottiche sono un esempio di FST. In questo caso una molecola, come un biopolimero, è chimicamente fissato a due sferule dielettriche di raggio micrometrico, che vengono poi manipolate per pressione di radiazione. E' quindi possibile strudiare l'elasticita' non lineare dei biopolimeri, misurando la forza esercitata sul polimero in funzione della distanza tra le due trappole (curva forza-distanza, FEC), con una risoluzione al di sotto del pico Newton in forza e del nanometro in distanza. Tra le diverse possibili configurazioni sperimentali per pinze ottiche, si distinguono le configurazioni in cui entrambe le estremità della molecola vengono manipolate da due trappole ottiche indipendenti e quelli in cui una delle due estremità è ancorato, come il sistema già in uso nello Small Biosystems Lab presso l'Università di Barcellona [2]. Molti dei più recenti risultati nel campo della biofisica singola molecola sono stati possibili grazie a sistemi sperimentali che funzionano con due trappole ottici indipendenti [3,4,5]. Questi sistemi hanno due caratteristiche salienti: da un lato questi strumenti permettono la manipolazione di una singola molecola usando solo fasci di luce, garantendo un migliore isolamento dal rumore ambientale, d'altro canto, questi strumenti possono misurare due segnali, uno per ogni trappola, e dare l'accesso ai cross-correlazione tra le forze in due punti del sistema sperimentale, una quantità che può fornire informazioni fisicamente rilevanti, non ottenibili con una trappola unica. Il nuovo set-up è stato sviluppato a partire da un setup sperimentale gia' in uso nel laboratorio. Cambiando il materiale delle sferule utilizzate per l'accoppiamento dei fasci di luce alla molecola con uno a piu' basso indice di rifrazione, abbiamo dimostrato la possibilità di utilizzare la stessa ottica per formare una singola trappola con due fasci contropropaganti o due trappole indipendenti. Lo sviluppo del sistema a due trappole ha richiesto anche la definizione di un nuovo protocollo di calibrazione e nuovi metodi di analisi dei dati basati sulla meccanica statistica, con particolare attenzione allo studio delle correlazioni incrociate. Per verificare il corretto funzionamento delle due trappole sono stati ripetuti alcuni degli esperimenti riportati in letteratura. Questi esperimenti sono descritti in dettaglio nel terzo capitolo della tesi. In primo luogo abbiamo riprodotto i risultati di H.C. Meiners S. Quake [3], misurando le correlazioni idrodinamiche tra due sfere intrappolate in trappole ottiche. Le correlazioni idrodinamiche si manifestano attraverso un minimo nella funzione di cross-correlazione tra le fluttuazioni di forza misurate nelle trappole. Un secondo esperimento consiste nella misurara della rigidità di molecole di DNA .I n un sistema con due trappole, la rigidita' puo' essere misurata direttamente dalle fluttuazioni. In questo caso si è verificato che il sistema descritto in questa tesi puo' esplorare una regime di forze (1-20 pN) piu' ampio di quelli riportati nella letteratura relativa a questo problema [6.7] (fino a 10 PN). In un terzo esperimento e' stata misurata la termodinamica e la cinetica di ripiegamento di un hairpin di DNA. Un hairpin di DNA e' una struttura secondaria formate da sequenze palindromiche di DNA a singolo filamento [4]. Queste strutture sono un sistema modello che è stato ampiamente studiato negli ultimi anni per capire la termodinamica degli acidi nucleici, o per capire la fenomenologia di piegatura (folding) di biopolimeri. In questo caso gli esperimenti sono stati fatti utilizzando le due diverse configurazioni sperimentali, con uno o due trappole, per verificare che la termodinamica del processo di folding non è influenzata dalle interazioni tra l'hairpin e la materia costitutiva delle microsfere di silica. Inoltre, questo esperimento ha richiesto lo sviluppo di tecniche per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, basate sull'uso della cross-correlazione tra i segnali emessi dai due trappole. Lo sviluppo del sistema di due trappole indipendenti è un primo passo nel quadro di un più ampio programma scientifico di ricerca sull' ugualianza di Jarzynski (JE). La JE e altre relazioni per sistemi non in equilibrio sono state studiate con le pinze ottiche negli ultimi anni [8]. La maggior parte di questi studi sono stati eseguiti su sistemi con una trappola unica. Il sistema di due trappole esplorerà nuove proprietà della JE, per esempio la non invarianza Galileiana, come spiegato nel quarto capitolo della tesi. Mentre gli esperimenti di non-equilibrio saranno effettuati dopo la conclusione della tesi, i fenomeni oggetto di studio sono modellate in dettaglio nei casi più semplici