Time-Restricted Feeding during Puberty Ameliorates Adiposity and Prevents Hepatic Steatosis in a Mouse Model of Childhood Obesity

: Background: Time restricted feeding (TRF) refers to dietary interventions in which food access is limited during a specific timeframe of the day. TRFs have proven useful in improving metabolic health in adult subjects with obesity. Their beneficial effects are mediated, in part, through modulating the circadian rhythm. Nevertheless, the translation of these dietary interventions onto obese/overweight children and adolescents remains uncharacterized. The objective of this study is to explore the feasibility of temporal dietary interventions for improving metabolic health in the context of childhood obesity. Methods: We have previously developed a mouse model of early adiposity (i.e., childhood obesity) through litter size reduction. Mice raised in small litters (SL) became obese as early as by two weeks of age, and as adults, they developed several obesity-related co-morbidities, including insulin resistance, glucose intolerance and hepatic steatosis. Here, we explored whether two independent short-term chrono-nutritional interventions might improve metabolic health in 1-month-old pre-pubertal SL mice. Both TRFs comprised 8 h feeding/14 h fasting. In the first one (TRF1) Control and SL mice had access to the diet for 8 h during the dark phase. In the second intervention (TRF2) food was available during the light:dark transitions. Results: TRF1 did not alter food intake nor ameliorate adiposity in SL-TRF1. In contrast, SL-TRF2 mice showed unintentional reduction of caloric intake, which was accompanied by reduced total body weight and adiposity. Strikingly, hepatic triglyceride content was completely normalized in SL-TRF1 and SL-TRF2 mice, when compared to the ad lib-fed SL mice. These effects were partially mediated by (i) clock-dependent signals, which might modulate the expression of Pparg or Cpt1a, and (ii) clockindependent signals, such as fasting itself, which could influence Fasn expression. Conclusions: Time-restricted feeding is an effective and feasible nutritional intervention to improve metabolic health, namely hepatic steatosis, in a model of childhood obesity. These data open new avenues for future safe and efficient chrono-nutritional interventions aimed to improve metabolic health in children with overweight/obesity

FGF21 mediates the lipid metabolism response to amino acid starvation

Abstract Lipogenic gene expression in liver is repressed in mice upon leucine deprivation. The hormone fi broblast growth factor 21 (FGF21), which is critical to the adaptive metabolic response to starvation, is also induced under amino acid deprivation. Upon leucine deprivation, we found that FGF21 is needed to repress expression of lipogenic genes in liver and white adipose tissue, and stimulate phosphorylation of hormone-sensitive lipase in white adipose tissue. The increased expression of Ucp1 in brown adipose tissue under these circumstances is also impaired in FGF21- defi cient mice. Our results demonstrate the important role of FGF21 in the regulation of lipid metabolism during amino acid starvation. ¿De Sousa-Coelho, A. L., J. Relat, E. Hondares, A. Pérez-Martí, F. Ribas, F. Villarroya, P. F. Marrero, and D. Haro. FGF21 mediates the lipid metabolism response to amino acid starvation

Neonatal overfeeding during lactation rapidly and permanently misaligns the hepatic circadian rhythm and programmes adult NAFLD

Childhood obesity is a strong risk factor for adult obesity, type 2 diabetes, and cardiovascular disease. The mechanisms that link early adiposity with late-onset chronic diseases are poorly characterised. We developed a mouse model of early adiposity through litter size reduction. Mice reared in small litters (SLs) developed obesity, insulin resistance, and hepatic steatosis during adulthood. The liver played a major role in the development of the disease. Objective: To gain insight into the molecular mechanisms that link early development and childhood obesity with adult hepatic steatosis and insulin resistance. Methods: We analysed the hepatic transcriptome (Affymetrix) of control and SL mice to uncover potential pathways involved in the long-term programming of disease in our model. Results: The circadian rhythm was the most significantly deregulated Gene Ontology term in the liver of adult SL mice. Several core clock genes, such as period 1e3 and cryptochrome 1e2, were altered in two-week-old SL mice and remained altered throughout their life course until they reached 4e6 months of age. Defective circadian rhythm was restricted to the periphery since the expression of clock genes in the hypothalamus, the central pacemaker, was normal. The period-cryptochrome genes were primarily entrained by dietary signals. Hence, restricting food availability during the light cycle only uncoupled the central rhythm from the peripheral and completely normalised hepatic triglyceride content in adult SL mice. This effect was accompanied by better re-alignment of the hepatic period genes, suggesting that they might have played a causal role in mediating hepatic steatosis in the adult SL mice. Functional downregulation of Per2 in hepatocytes in vitro confirmed that the period genes regulated lipid-related genes in part through peroxisome proliferator-activated receptor alpha (Ppara). Conclusions: The hepatic circadian rhythm matures during early development, from birth to postnatal day 30. Hence, nutritional challenges during early life may misalign the hepatic circadian rhythm and secondarily lead to metabolic derangements. Specific time-restricted feeding interventions improve metabolic health in the context of childhood obesity by partially re-aligning the peripheral circadian rhythm

Dietary betaine supplementation increases Fgf21 levels to improve glucose homeostasis and reduce hepatic lipid accumulation in mice

Identifying markers of human insulin resistance may permit development of new approaches for treatment and prevention of type 2 diabetes. To this end, we analyzed the fasting plasma metabolome in metabolically characterized human volunteers across a spectrum of insulin resistance. We demonstrate that plasma betaine levels are reduced in insulin-resistant humans and correlate closely with insulin sensitivity. Moreover, betaine administration to mice with diet-induced obesity prevents the development of impaired glucose homeostasis, reduces hepatic lipid accumulation, increases white adipose oxidative capacity, and enhances whole-body energy expenditure. In parallel with these beneficial metabolic effects, betaine supplementation robustly increased hepatic and circulating fibroblast growth factor (Fgf)21 levels. Betaine administration failed to improve glucose homeostasis and liver fat content in Fgf21(-/-) mice, demonstrating that Fgf21 is necessary for betaine's beneficial effects. Together, these data indicate that dietary betaine increases Fgf21 levels to improve metabolic health in mice and suggest that betaine supplementation merits further investigation as a supplement for treatment or prevention of type 2 diabetes in humans

Regulació de FGF21 en la cèl·lula muscular

[cat] Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.[eng] Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine

Regulació de FGF21 en la cèl·lula muscular

[cat] Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.[eng] Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine

Regulació de FGF21 en la cèl·lula muscular

[cat] Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.[eng] Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine

Regulació de FGF21 en la cèl·lula muscular

[cat] Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.[eng] Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine

Regulació de FGF21 en la cèl·lula muscular

[cat] Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.[eng] Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine

Regulació de FGF21 en la cèl·lula muscular

[cat] Tot i que el fetge és considerat com el principal lloc de producció del FGF21 sistèmic, sobretot en condicions de dejuni i sota control de PPARα, darrerament s’han acumulat diverses evidències que indiquen que FGF21 també pot actuar com a mioquina, un factor hormonal que pot ser produït i alliberat a la circulació pel múscul esquelètic. Concretament, s’ha observat que pacients que pateixen malalties neuromusculars causades per alteracions en la funció mitocondrial, com ara mutacions i deplecions al DNA mitocondrial, presenten valors d’expressió d’FGF21 incrementats, així com també els de la seva secreció a la circulació. Per tant, alguns indicis mostren que el múscul pot ser un lloc de producció i secreció d’FGF21 associat a l’estrès mitocondrial muscular. Durant la realització d’aquesta tesi, hem trobat que l’expressió i la secreció d’FGF21 en un context de cèl•lula muscular estan íntimament associades amb la diferenciació miogènica tant en rosegadors com en models humans. Per contra, els nivells dels seus receptors es mantenen bastant estables, mentre que pel que fa al cofactor β-Klotho, necessari pel seu procés de senyalització, no es detecta expressió del transcrit. Aquest fet suggereix, que la cèl•lula muscular podria ser una font d’expressió i secreció d’FGF21, però no un teixit diana d’aquesta. A part, s’ha identificat el factor miogènic MyoD com a un regulador molt potent de la transcripció del gen FGF21, així com també se n’ha mapat la regió del promotor responsable de vehicular aquest efecte. D’altra banda, s’han intentat descriure altres factors de transcripció i coreguladors que poden actuar com a activadors o inhibidors, els quals poden estar involucrats en el control de la transcripció gènica d’FGF21, com ara els PPARs, PGC-1α o Sirt1, així com també esbrinar els efectes de diversos activadors naturals i sintètics. En aquest sentit, val la pena destacar que dins d’un context en presència del factor miogènic MyoD s’ha identificat a PPARα, juntament amb el seu activador, com a un clar activador de l’activitat transcripcional d’aquest promotor. PGC-1α, sembla actuar de la mateixa manera, potenciant-ne l’efecte en presència de MyoD. Per contra, Sirt1 s’ha revelat com a un inactivador de l’activitat transcripcional del gen FGF21 en presència del factor MyoD. Altres experiments indiquen que el tractament amb diferents àcids grassos no sorgeixen cap efecte sobre l’expressió ni la secreció del gen en el context muscular, sinó més aviat el contrari, malgrat que la cèl•lula muscular es mostrava sensible a l’acció dels àcids grassos sobre altres gens. De la mateixa manera que ja indicaven determinats indicis bibliogràfics, vam poder comprovar que pacients de patologia MNGIE (miopatia associada a alteracions del DNA mitocondrial), mostraven la presència d’alts nivells d’FGF21 circulants. Així doncs, intentant mimetitzar una disfunció mitocondrial experimentalment, utilitzant inhibidors de la cadena respiratòria/fosforilació oxidativa, es van poder confirmar aquests increments d’expressió i secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars. Investigant una mica més a fons la mecanística de tot el procés, es va veure que l’increment de la producció d’espècies reactives d’oxigen derivades d’aquesta disfunció, provocava una inducció de la p38-MAP cinasa i conseqüentment l’activació ATF2, el qual és capaç d’interaccionar amb el seu lloc d’unió en la regió proximal del promotor del gen FGF21, provocant així aquest efecte sobre el gen FGF21 a les cèl•lules miogèniques. Alhora, s’ha descrit que la presència de MyoD és imprescindible per tal que es doni la resposta de la transcripció del gen FGF21 a la disfunció mitocondrial induïda experimentalment, justificant la resposta d’increment de la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules musculars en resposta a aquesta disfunció. Aquests canvis en la secreció d’FGF21 per part de les cèl•lules miogèniques en resposta a les afectacions a nivell mitocondrial, també poden ser un reflex del mecanisme fisiològic pel qual es detecten canvis a nivell d’estatus energètic a nivell muscular. D’aquesta manera, un increment de l’alliberació d’FGF21 podria desencadenar diferents respostes metabòliques adaptatives a nivell sistèmic. Aquest procés posa de manifest la gran capacitat que té la funció mitocondrial, per tal d’influenciar en el metabolisme sistèmic a través de la senyalització mitocondrial retrògrada. Així doncs, aquest mecanisme de senyalització permet l’expressió i alliberació de molècules d’acció endocrina com ara FGF21 i reforça la idea de considerar el múscul esquelètic com a una important font d’FGF21, la qual podem considerar com a una mioquina.[eng] Although the liver is generally considered the main production site for fibroblast growth factor-21 (FGF21), high FGF21 levels have been found to be associated with neuromuscular mitochondrial genetic diseases, and there are indications that shows muscle as a source of FGF21 production under conditions of muscular mitochondrial stress. In this thesis we describe that FGF21 expression and release is associated with myogenic differentiation in different muscular cell lines. However, FGFRs transcription levels don’t change across differentiation and β-Klotho is undetectable, suggesting that muscle cells as a source but not as a target of FGF21. Furthermore we have identified MyoD as a major controller of FGF21 gene transcription, as well as we have mapped the most important region in the promoter responsible for MyoD-dependent regulation. Moreover, we determined the role of some transcription factors and co-regulators potentially involved in the control of FGF21 gene transcription, such as PPARs, PGC-1α or Sirt1, as well as several natural and synthetic agents (e.g. fatty acids) On the other hand, mimicking mitochondrial dysfunction by the use of respiratory chain/oxidative phosphorylation inhibitors resulted in enhanced expression and release of FGF21 by muscle cells. Increased production of reactive oxygen species, subsequent induction of p38-MAP kinase and activation of an ATF2-binding site at the proximal promoter region of the FGF21 gene were found to comprise the major mechanism connecting mitochondrial dysfunction and enhanced FGF21 gene transcription in myogenic cells. Furthermore, we show that MyoD is required for the responsiveness of FGF21 gene transcription to experimentally induced mitochondrial dysfunction, which explains the preferential response of muscle cells to enhanced FGF21 secretion in response to mitochondrial alterations. FGF21 release by muscle cells in response to mitochondrial alterations may reflect a physiological mechanism by which the sensing of internal energetic status by muscle tissue results in the release of FGF21 to favor systemic metabolic adaptations. This process highlights the capacity of mitochondrial function to influence systemic metabolism by retrograde signaling, which leads to the expression and release of molecules with endocrine action, such as FGF2,1 and reinforces the concept of considering the skeletal muscle as an important source of the FGF21, as well as to consider FGF21 as a myokine