Funktionelle Analyse und Regulation des Zinkfingerproteins Gfi1 bei Lymphozyten anhand gentechnisch veränderter Mäuse

Gfi1 ist ein nukleäres Zink-Finger Protein, das als transkriptioneller Repressor agiert und wichtige Funktion in der T-Zellentwicklung, in der Granulopoese und in der angeborenen Immunantwort besitzt. Um die in vivo Regulation und Expression von Gfi1 eingehend untersuchen zu können, wurde das Gfi1 Gen in der Maus durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen so verändert, dass fast die komplette kodierende Region durch das Reportergen GFP ersetzt wurde. Gleichzeitig wurde ein Teil des Gfi1 Gens so deletiert, dass sowohl der gesamte Promoterbereich, als auch das letzte Exon, das das Polyadenylierungssignal enthält, intakt blieben. Rekombination beider Gfi1 Allele führte zu einer Deletion des Gfi1 Gens. Diese Tiere zeigen denselben Phänotyp wie die publizierte Gfi1-KO Mausmutante (Karsunky et al., 2002), in der das Gfi1 Gen durch die Insertion des Neomycin Gens inaktiviert wurde. Die höchste Gfi1 Expression während der B-Zell Differenzierung im Knochenmark wurde in den frühen B-Zell-Subpopulationen gefunden. Während der T-Zellentwicklung ist die Gfi1 Expression auf ihrem höchsten Niveau in den Stadien der prä-TCR und der TCR abhängiger Differenzierungsschritte. In reifen B-Zellen findet keine Gfi1 Expression statt, allerdings ist diese nach Stimulation hochreguliert. Im Gegensatz dazu zeigen die peripheren T-Zellen eine geringe, basale Gfi1 Expression, die nach Aktivierung über den TCR stark zunimmt, um anschließend in den Gedächtniszellen wieder abzuklingen. Die konstitutive Expression von Gfi1 unter dem lck-Promoter in den Gfi1GFP/GFP-Mäusen führte zur transkriptionellen Repression des Gfi1:GFP Allels in den T-Zellen. In vivo sowie in vitro Experimente bestätigten die Hypothese, dass Gfi1 durch direkte Bindung an den eigenen Promotor, die eigene transkriptionelle Aktivität über Rückkopplungsmechanismen selbst reguliert. Mit Hilfe der publizierten Gfi1-defizienten Maus wurde die essentielle Rolle von Gfi1 während der Thymozyten-Reifung weiter untersucht. Diese Mäuse zeigen eine drastische Reduktion der Thymozytenzahl, die auf eine erhöhte Apoptoserate, Verlust der Proliferation und einen Differenzierungsblock in den sehr frühen Lin-c-Kit+ T-Vorläuferzellen zurückzuführen ist. Diese Zellen stellen die ersten zytokinabhängigen T-Vorläuferzellen dar, die noch keine V(D)J-Umgruppierung des T-Zellrezeptor b Lokus vorgenommen haben und auch noch keiner Selektion unterworfen wurden. Ein weiterer wichtiger Befund aus den Gfi1-KO Tieren ist, dass Gfi1 im Prozess der positiv/negativ Selektion von Thymozyten und der damit verbundenen CD4/CD8-Linienentscheidung eine wichtige Funktion zukommt. In den Gfi1-defizienten Thymus konnte eine Beschleunigung der MHC Klasse I restringierten positiv Selektion als auch eine prozentual vermehrte Bildung von CD8+-SP-T-Zellen festgestellt werden. Durch vergleichende DNA Mikroarray Analysen von sortierten DP und gesamt Thymozyten aus Gfi1-defizienten Tieren und WT-Kontrollen konnte gezeigt werden, dass die Expression spezifischer Gene von Gfi1 reprimiert wird. Eine deregulierte hohe Expression in den Gfi1-defizienten Zellen konnte für die Gene Id1, Id2, LKLF und TRAF5 gezeigt werden. Diese Befunde deuten auf die Existenz neuer Regulationmechanismen während der prä-T-Zellentwicklung und Selektionsprozessen hin, in denen Gfi1 eine essentielle Rolle spielt

The Transcriptional Repressor Gfi1 Affects Development of Early, Uncommitted c-Kit+ T Cell Progenitors and CD4/CD8 Lineage Decision in the Thymus

In the thymus, several steps of proliferative expansion and selection coordinate the maturation of precursors into antigen-specific T cells. Here we identify the transcriptional repressor Gfi1 as an important regulator of this maturation process. Mice lacking Gfi1 show reduced thymic cellularity due to an increased cell death rate, lack of proliferation, and a differentiation block in the very early uncommitted CD4−/CD8−/c-Kit+ cytokine-dependent T cell progenitors that have not yet initiated VDJ recombination. In addition, Gfi1-deficient mice show increased major histocompatibility complex class I–restricted positive selection and develop significantly more CD8+ cells suggesting a requirement of Gfi1 for a correct CD4/CD8 lineage decision. Absence of Gfi1 correlates with high level expression of the genes for lung Krüppel-like factor (LKLF), inhibitor of DNA binding (Id)1 and Id2, suggesting the existence of new regulatory pathways in pre-T cell development and thymic selection in which Gfi1 acts upstream of LKLF as well as the E-proteins, which are negatively regulated by Id1 and Id2

Functions of the Membrane-Associated and Cytoplasmic Malate Dehydrogenases in the Citric Acid Cycle of Corynebacterium glutamicum

Like many other bacteria, Corynebacterium glutamicum possesses two types of l-malate dehydrogenase, a membrane-associated malate:quinone oxidoreductase (MQO; EC 1.1.99.16) and a cytoplasmic malate dehydrogenase (MDH; EC 1.1.1.37) The regulation of MDH and of the three membrane-associated dehydrogenases MQO, succinate dehydrogenase (SDH), and NADH dehydrogenase was investigated. MQO, MDH, and SDH activities are regulated coordinately in response to the carbon and energy source for growth. Compared to growth on glucose, these activities are increased during growth on lactate, pyruvate, or acetate, substrates which require high citric acid cycle activity to sustain growth. The simultaneous presence of high activities of both malate dehydrogenases is puzzling. MQO is the most important malate dehydrogenase in the physiology of C. glutamicum. A mutant with a site-directed deletion in the mqo gene does not grow on minimal medium. Growth can be partially restored in this mutant by addition of the vitamin nicotinamide. In contrast, a double mutant lacking MQO and MDH does not grow even in the presence of nicotinamide. Apparently, MDH is able to take over the function of MQO in an mqo mutant, but this requires the presence of nicotinamide in the growth medium. It is shown that addition of nicotinamide leads to a higher intracellular pyridine nucleotide concentration, which probably enables MDH to catalyze malate oxidation. Purified MDH from C. glutamicum catalyzes oxaloacetate reduction much more readily than malate oxidation at physiological pH. In a reconstituted system with isolated membranes and purified MDH, MQO and MDH catalyze the cyclic conversion of malate and oxaloacetate, leading to a net oxidation of NADH. Evidence is presented that this cyclic reaction also takes place in vivo. As yet, no phenotype of an mdh deletion alone was observed, which leaves a physiological function for MDH in C. glutamicum obscure

Transcription factor Gfi1 regulates self-renewal and engraftment of hematopoietic stem cells

The generation of all blood cells depends on the ability of hematopoietic stem cells (HSCs) for self-renewal and multilineage differentiation. We show here that the transcription factor Gfi1 is expressed in HSCs and in more mature cells such as common lymphoid progenitors (CLPs) and granulo/monocytic progenitors, but is absent in common myeloid progenitors and megakaryocyte/erythroid progenitors. When Gfi1 is deleted in mice, HSC frequencies are significantly reduced and CLPs all but disappear from the bone marrow. This specific requirement of Gfi1 for the maintenance of HSC numbers is cell autonomous. Transplantation of Gfi1-deficient bone marrow results in a compromised radioprotection and lower numbers of colony forming units in the spleen of wild-type recipients. Strikingly, Gfi1(−/−) bone marrow cells are severely impaired in competitive long-term reconstituting abilities after transplantation and show a surprisingly high proportion of actively cycling HSCs, suggesting that Gfi1 restrains proliferation of HSCs and thereby regulates their self-renewal and long-term engraftment abilities