Desenvolvimento de filmes nanoestruturados pela técnica de layer-by-layer para controle de cinética de liberação proteica

Orientador : Prof. Dr. Roberto PontaroloCo-orientador : Prof. Dr. Rilton Alves de FreitasDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 08/03/2013Bibliografia : fls. 67-79Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: O desenvolvimento de um novo sistema de liberação de fármacos com base em membranas de celulose bacteriana (CB) revestidas com filmes nanoestruturados é apresentado. Neste trabalho, foi realizada a deposição de múltiplas camadas dos biopolímeros quitosana e alginato pela técnica de Layer-by-Layer (LbL) sobre membranas de CB modificadas quimicamente por carboxilação com o reagente 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (TEMPO). O processo de alteração da estrutura química das cadeias de celulose foi confirmado por análises de infravermelho e espectroscopia fotoeletrônica de raios X, ao passo que o estudo da interação da membrana modificada frente aos polímeros foi efetuado com o auxílio de filmes ultrafinos: modelos de CB modificados com reagente TEMPO foram submetidos ao processo de LbL sob acompanhamento em tempo real de microbalança de cristal de quartzo e elipsometria. Os ensaios revelaram que a superfície carboxilada é capaz de adsorver uma quantidade maior da camada inicial de quitosana (-105±1,5 Hz/ 14,1±0,8 nm) em comparação à interface de CB (-6,0±0,2 Hz/ 11,0±2,4 nm), além de permitir a formação de multicamadas mais espessas e com maior massa, comprovando que a modificação química lhe confere maior afinidade em relação aos polímeros. A deposição polimérica foi efetuada sobre as membranas por duas metodologias distintas de LbL, imersão e spray, e subsequentemente avaliadas por microscopia de força atômica e fluorescência confocal à laser. Os resultados exibiram a presença de pequenos agregados nodulares para a amostra nebulizada e uma deposição mais homogênea e regular para a membrana imersa nas soluções poliméricas, porém em ambas as amostras a adsorção ocorre sobre a superfície das fibras que compõe a membrana. Assim, é possível observar que a organização e arquitetura molecular diferem de acordo com a forma de interação, gerando recobrimentos com diferentes morfologias. Na última etapa do trabalho avaliou-se a capacidade da membrana modificada em interagir com a proteína fator de crescimento epidermal (EGF) através de adsorção em meio estático e liberá-la a partir de sistemas revestidos pelas metodologias de spray e imersão, compreendidas na técnica de LbL. Os resultados exibiram uma incorporação de 10,3±0,7% em 24 horas, revelando que a membrana apresenta uma grande capacidade de imobilização do EGF por um período de tempo prolongado de até 96 horas. Os ensaios de liberação exibiram uma liberação gradual da proteína em até 30 horas, de maneira que o grupo controle apresentou a liberação de mais de 85% do total incorporado, ao passo que as amostras revestidas atingiram um máximo de 25% no mesmo período de tempo avaliado. Portanto, um sistema capaz de carrear a proteína EGF e, simultaneamente, efetuar interações de natureza eletrostática com polímeros carregados opostamente foi descrito. O sistema gerado apresenta a capacidade de controlar a liberação do fármaco incorporado por um período prolongado de até 30 horas, apresentando grande utilidade para tratamento de queimaduras e processos de cicatrização.Abstract: The development of a new drug delivery system based on bacterial cellulose (BC) membranes coated with nanostructured films is reported. In this work we introduce a multilayer deposition of chitosan and alginate by the Layer-by-Layer (LbL) technique on modified BC membranes by carboxylation with 2,2,6,6- tetramethylpiperidinyl-1-oxyl (TEMPO) radical. Cellulose modification was confirmed by infrared analysis and X-ray photoelectron spectroscopy, whereas the evaluation of polymer interaction towards the modified membrane was performed with ultrathin films: TEMPO modified BC model films were submitted to LbL and the process was followed in real time by crystal quartz microbalance and ellipsometry, revealing that the carboxylated surface adsorbs an increased amount of chitosan as the first layer (- 105±1.5 Hz/ 14.1±0.8 nm) in comparison with BC interface (-6.0±0.2 Hz/ 11.0±2.4 nm), apart from enabling the build-up of greater and thicker multilayers that testifies the enhanced interaction provided by the chemical modification. LbL deposition onto membranes was performed by two distinct methodologies, dipping and spray, subsequently analyzed by atomic force microscopy and confocal laser scanning microscopy that revealed the presence of nodular aggregates for the sprayed sample, where a more regular and flat deposition for dipped samples though polymer adsorption occurs exclusively on top of membrane fibers. Therefore, it is possible to observe different molecular architectures and organizations degrees by LbL methodology, each leading to a flatter or greater deposition. In the last part of this work, we studied the modified membrane ability to interact with the protein epidermal growth factor (EGF) trough adsorption in a static medium and release through systems coated by the LbL technique of spray and dipping. Results exhibited the immobilization of approximately 10.3±0.7% of protein uptake in a prolonged period of time until 96 hours. Protein releasing experiments revealed a gradual protein release until the period of 30 hours. The control group lost more than 85% of total incorporated protein, while the coated samples reached a maximum release of 25% in the same time interval. Therefore we describe an EGF delivery system able to simultaneously interact with oppositely charged polyelectrolytes and releasing it in a sustainable manner that presents great applicability for burning and wound treatments

Synthesis and characterization of acoustic-sensitive perfluorinated microvesicles and nanocapsules for theranostic application

Orientador : Dr. Rilton Alves de FreitasCoorientador : Dr. Nicolas TsapisCoorientador : Dr. Roberto PontaroloTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 15/02/2017Inclui referências : f. 39-45;64-67;92-94;147-153Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: Compostos fluorados são intensamente utilizados como agentes de contraste ultrassônicos (ACU) por facilitar o diagnóstico de diversas doenças via geração de imagens em temporeal. Todos os ACU disponíveis comercialmente são microbolhas constituídas por um núcleo gasoso fluorado que é estabilizado por finas camadas de fosfolipídios, proteínas ou surfactantes. Infelizmente, a aplicação teranóstica (i.e. habilidade terapêutica e diagnóstica) de tais compostos é severamente limitada devido a (i) baixa estabilidade do componente fluorado, (ii) tamanho inerente à escala micrométrica, (iii) ausência de compartimentos efetivos para acumulação de fármacos. A fim de superar estas limitações, nós propomos duas estratégias distintas para aumentar a persistência do núcleo fluorado e, simultaneamente, prover interfaces funcionais para encapsulação de fármacos. A primeira abordagem envolve a intercalação de quitosana com fosfolipídios (DSPC) a fim de aumentar a estabilidade de microvesículas contendo o gás fluorado decafluorobutano (C4F10). A afinidade entre DSPC e quitosana foi inicialmente verificado através de técnicas sensíveis de superfície e microscopia de fluorescência. Análises de ressonância magnética nuclear de 19F (19F-RMN) e imagens ultrassônicas in vitro mostraram sinais intensos do componente gasoso após 48h, o dobro comparado com amostras sem quitosana. Desta forma, o revestimento com quitosana foi capaz de prolongar a estabilidade de microvesículas e consiste em uma plataforma adequada pra acumulação de fármacos. A camada interfacial formada por DSPA-quitosana pode, portanto, incrementar o potencial teranóstico de microvesículas. Entretanto, o uso de gás fluorado impôs uma importante restrição à estabilização de vesículas na escala nanométrica. Assim, a segunda estratégia estudada neste trabalho foi focada no desenvolvimento de agentes com habilidade teranóstica na nanoescala. Para tal, buscou-se encapsular um líquido fluorado, o perfluorohexano (PFH; C6F14), dentro um rígida cápsula polimérica de polilactídio (PLA). A fim de melhorar a interação entre polímeros biodegradáveis para com perfluorocarbonos, nós sintetizamos polímeros de PLA contendo grupamentos terminais fluorados com cinco diferentes comprimentos (desde C3F7 até C13F27) via polimerização por abertura de anel do D,L-lactídio. Resultados de relaxação 19F spin-spin mostraram a presença de interações entre os componentes fluorados e, subsequentemente, todos os polímeros foram formulados em nanocápsulas (NC) esféricas com um diâmetro de 150 nm como verificado por microscopia eletrônica de transmissão. Ensaios de 19F-RMN mostraram que as NC preparadas com polímeros fluorados dobraram a eficiência de encapsulação de PFH comparado com derivativos não fluorados. Estas NC aumentaram a ecogenicidade em 10 vezes para modalidades de imagens ultrassonoras fundamental e harmônica. Além disso, a vaporização acústica do PFH foi realizada por ultrassom focalizado, através da observação de cápsulas fragmentadas ou despedaçadas em diversas amostras. Os efeitos provenientes dos grupamentos fluorados foram explorados via avaliação da morfologia de microcápsulas (MC) produzidas com os polímeros. Finalmente, tanto as NC como as MC apresentam um interessante potencial teranóstico, sendo capazes de efetuar diagnóstico assistido por ultrassom e são potencialmente hábeis em liberar fármacos quando irradiados por altas pressões acústicas.Abstract: Fluorinated materials are intensively used as ultrasound contrast agents (UCA) to facilitate the diagnosis of many diseases by real-time imaging. All the commercially available UCAs are microbubbles constituted by a perfluorinated gaseous-core stabilized by a monolayer of phospholipids, proteins or surfactants. Unfortunately, the theranostic application (i.e. therapeutic and diagnostic ability) of such materials are severely limited by the (i) poor stability of the fluorinated component, (ii) inherent micrometer size range and (iii) lack of effective compartments for drug accumulation. To overcome these limitations, we proposed two different strategies to improve the persistence of the fluorinated core and simultaneously provide functional interfaces for drug encapsulation. The first approach involves intercalating chitosan with phospholipids (DSPC) to increase the stability of microvesicles containing the fluorinated gas decafluorobutane (C4F10). The affinity of DSPC and chitosan was disclosed by surface sensitive techniques and fluorescence microscopy. 19F nuclear magnetic resonance (19F-NMR) and in vitro ultrasound of chitosancoated microvesicles exhibited intense signals of the gaseous-component after 48 h, twice as long compared to plain samples. Altogether, chitosan increased the stability of microvesicles and is a suitable platform for drug accumulation. As a result, the chitosanphospholipid shell may enhance the theranostic potential of related microvesicles. However, the use of a fluorinated gas-core imposed an important restriction to stabilize submicrometric vesicles. Therefore, the second strategy was focused in developing a theranostic agent at the nanoscale by entrapping a liquid fluorinated core of perfluorohexane (PFH; C6F14) into a rigid polymeric shell of polylactide (PLA). To enhance the interaction of biodegradable polymers with perfluorocarbons, we synthesized PLA polymers containing five distinct lengths of fluorinated end-groups (from C3F7 until C13F27) by ring-opening polymerization of D,L-lactide. A greater extent of fluorous interactions was indicated by 19F spin-spin relaxation time and, subsequently, all the block copolymers were formulated into spherical nanocapsules (NC) with average diameter of 150 nm as verified by transmission electron microscopy. 19F-NMR showed that NC produced with fluorinated polymers increased two-fold the encapsulation efficiency of PFH compared with non-fluorinated derivatives. As a result, the NC echogenicity increased 10-fold for both fundamental and harmonic ultrasound imaging modalities. In addition, acoustic drop vaporization of PFH was successfully attained by focused ultrasound as observed by fragmented or disrupted morphologies in many samples. Effects of the fluorinated end-groups were further explored by a morphological evaluation of microcapsules (MC) produced with the polymers. Finally, both NC and MC present an interesting theranostic potential, being able to perform ultrasound-assisted diagnosis and potentially release drug contents when irradiated by high acoustic pressures.Résumé: Les composés fluorés sont très utilisés dans les agents de contraste ultrasonore (ACU) pour faciliter le diagnostic de nombreuses maladies par imagerie en temps réel. Tous les ACU commerciaux sont des microbulles de gaz perfluoré stabilisé par une monocouche de phospholipides, protéines ou tensioactifs. Cependant, l'application théranostique (de la contraction de thérapeutique et de diagnostic) de ces matériaux est sévèrement limitée par (i) la faible stabilité du composé fluoré, (ii) leur taille micrométrique et (iii) le manque de compartiments efficaces pour l'encapsulation d'un principe actif. Nous avons proposé deux stratégies différentes pour améliorer la stabilité du coeur fluoré et fournir simultanément des interfaces fonctionnelles pour l'encapsulation d'un principe actif. La première approche a consisté à intercaler le chitosane avec des phospholipides (DSPC) pour augmenter la stabilité de microvésicules contenant du gaz fluoré décafluorobutane (C4F10). L'affinité du DSPC et du chitosane a été révélée par des techniques de caractérisation de surface et par microscopie à fluorescence. Les microvésicules contenant du chitosane ont présenté des signaux intenses de la composante gazeuse en résonance magnétique nucléaire du fluor (RMN 19F) et en échographie in vitro après 48 h, deux fois plus longtemps que les échantillons sans chitosane. Le chitosane permet ainsi d'augmenter la stabilité des microvésicules et constitue une plateforme appropriée pour l'encapsulation de médicaments. La coque de chitosane-phospholipide pourrait donc améliorer le potentiel théranostique de ces microvésicules. Cependant, l'utilisation d'un coeur gazeux a rendu la stabilisation de vésicules submicrométriques difficile. Par conséquent, la deuxième stratégie s'est focalisée sur le développement d'un agent théranostique à l'échelle nanométrique en piégeant un coeur fluoré liquide de perfluorohexane (PFH; C6F14) dans une enveloppe polymère rigide de polylactide (PLA). Pour améliorer l'interaction des polymères biodégradables avec les perfluorocarbones, nous avons synthétisé des polymères PLA contenant cinq longueurs différentes de groupes terminaux fluorés (de C3F7 à C13F27) par polymérisation par ouverture de cycle du D,L-lactide. Les mesures de temps de relaxation spin-spin 19F ont démontré la présence d'interactions fluorophiles intenses entre les chaînons fluorés et le PFH. Les polymères ont ensuite été formulés en nanocapsules (NCs) sphériques de 150 nm de diamètre, comme vérifié par microscopie électronique en transmission. La RMN 19F a montré que l'efficacité d'encapsulation du PFH dans les capsules est doublée grâce à l'utilisation des polymères fluorés comparé aux dérivés non fluorés. Par conséquent, la réponse acoustique des NCs a été multipliée par dix avec les deux modes d'imagerie fondamentale et harmonique. En outre, l'utilisation d'ultrasons focalisés a permis la vaporisation acoustique de gouttelettes de PFH, confirmée par l'observation de morphologies fragmentées ou perturbées dans de nombreux échantillons. Les effets des groupes terminaux fluorés ont été davantage explorés par une évaluation morphologique des microcapsules (MCs) produites avec les polymères. Finalement, les NCs et MCs présentent un potentiel théranostique intéressant, puisqu'elles permettent d'effectuer un diagnostic assisté par ultrasons et de libérer potentiellement un principe actif lorsqu'elles sont soumises à des pressions acoustiques élevées

A epidemia do Diabetes mellitus encontra a pandemia da SARS-CoV-2 (COVID-19) / The Diabetes mellitus epidemic meets the SARS-CoV-2 (COVID-19) pandemic

A pandemia da doença coronavírus 2019 (COVID-19; SARS-Co-2) surgiu como um dos maiores desafios enfrentados pela humanidade. O diabetes mellitus, associado a hiperglicemia crônica, favorece comorbidades que podem ampliar o risco de severidade ou morte quando associado a viremia de COVID-19. A Idade avançada, múltiplas morbidades, hiperglicemia, doença cardíaca e resposta inflamatória severa são preditores de desfechos desfavoráveis na presença da viremia. Os diferentes aspectos da COVID-19 e suas associações com o diabetes mellitus, são abordados. A relação da enzima conversora de angiotensionogênio (ACE2), o controle glicêmico e diferentes aspectos da severidade e prognóstico são descritos em relação ao diabetes-COVID-19. Também são comentadas as medidas para prevenir a propagação da viremia com ênfase em orientações e no gerenciamento de procedimentos hospitalares e ambulatórias para o paciente com diabetes, em particular no sistema público de saúde. Esta revisão resume o conhecimento atual e os desafios percebidos para prevenção e gestão de COVID-19 em pessoas com diabetes

Synthesis and characterization of acoustic-sensitive perfluorinated microvesicles and nanocapsules for theranostic application

Orientador : Dr. Rilton Alves de FreitasCoorientador : Dr. Nicolas TsapisCoorientador : Dr. Roberto PontaroloTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 15/02/2017Inclui referências : f. 39-45;64-67;92-94;147-153Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: Compostos fluorados são intensamente utilizados como agentes de contraste ultrassônicos (ACU) por facilitar o diagnóstico de diversas doenças via geração de imagens em temporeal. Todos os ACU disponíveis comercialmente são microbolhas constituídas por um núcleo gasoso fluorado que é estabilizado por finas camadas de fosfolipídios, proteínas ou surfactantes. Infelizmente, a aplicação teranóstica (i.e. habilidade terapêutica e diagnóstica) de tais compostos é severamente limitada devido a (i) baixa estabilidade do componente fluorado, (ii) tamanho inerente à escala micrométrica, (iii) ausência de compartimentos efetivos para acumulação de fármacos. A fim de superar estas limitações, nós propomos duas estratégias distintas para aumentar a persistência do núcleo fluorado e, simultaneamente, prover interfaces funcionais para encapsulação de fármacos. A primeira abordagem envolve a intercalação de quitosana com fosfolipídios (DSPC) a fim de aumentar a estabilidade de microvesículas contendo o gás fluorado decafluorobutano (C4F10). A afinidade entre DSPC e quitosana foi inicialmente verificado através de técnicas sensíveis de superfície e microscopia de fluorescência. Análises de ressonância magnética nuclear de 19F (19F-RMN) e imagens ultrassônicas in vitro mostraram sinais intensos do componente gasoso após 48h, o dobro comparado com amostras sem quitosana. Desta forma, o revestimento com quitosana foi capaz de prolongar a estabilidade de microvesículas e consiste em uma plataforma adequada pra acumulação de fármacos. A camada interfacial formada por DSPA-quitosana pode, portanto, incrementar o potencial teranóstico de microvesículas. Entretanto, o uso de gás fluorado impôs uma importante restrição à estabilização de vesículas na escala nanométrica. Assim, a segunda estratégia estudada neste trabalho foi focada no desenvolvimento de agentes com habilidade teranóstica na nanoescala. Para tal, buscou-se encapsular um líquido fluorado, o perfluorohexano (PFH; C6F14), dentro um rígida cápsula polimérica de polilactídio (PLA). A fim de melhorar a interação entre polímeros biodegradáveis para com perfluorocarbonos, nós sintetizamos polímeros de PLA contendo grupamentos terminais fluorados com cinco diferentes comprimentos (desde C3F7 até C13F27) via polimerização por abertura de anel do D,L-lactídio. Resultados de relaxação 19F spin-spin mostraram a presença de interações entre os componentes fluorados e, subsequentemente, todos os polímeros foram formulados em nanocápsulas (NC) esféricas com um diâmetro de 150 nm como verificado por microscopia eletrônica de transmissão. Ensaios de 19F-RMN mostraram que as NC preparadas com polímeros fluorados dobraram a eficiência de encapsulação de PFH comparado com derivativos não fluorados. Estas NC aumentaram a ecogenicidade em 10 vezes para modalidades de imagens ultrassonoras fundamental e harmônica. Além disso, a vaporização acústica do PFH foi realizada por ultrassom focalizado, através da observação de cápsulas fragmentadas ou despedaçadas em diversas amostras. Os efeitos provenientes dos grupamentos fluorados foram explorados via avaliação da morfologia de microcápsulas (MC) produzidas com os polímeros. Finalmente, tanto as NC como as MC apresentam um interessante potencial teranóstico, sendo capazes de efetuar diagnóstico assistido por ultrassom e são potencialmente hábeis em liberar fármacos quando irradiados por altas pressões acústicas.Abstract: Fluorinated materials are intensively used as ultrasound contrast agents (UCA) to facilitate the diagnosis of many diseases by real-time imaging. All the commercially available UCAs are microbubbles constituted by a perfluorinated gaseous-core stabilized by a monolayer of phospholipids, proteins or surfactants. Unfortunately, the theranostic application (i.e. therapeutic and diagnostic ability) of such materials are severely limited by the (i) poor stability of the fluorinated component, (ii) inherent micrometer size range and (iii) lack of effective compartments for drug accumulation. To overcome these limitations, we proposed two different strategies to improve the persistence of the fluorinated core and simultaneously provide functional interfaces for drug encapsulation. The first approach involves intercalating chitosan with phospholipids (DSPC) to increase the stability of microvesicles containing the fluorinated gas decafluorobutane (C4F10). The affinity of DSPC and chitosan was disclosed by surface sensitive techniques and fluorescence microscopy. 19F nuclear magnetic resonance (19F-NMR) and in vitro ultrasound of chitosancoated microvesicles exhibited intense signals of the gaseous-component after 48 h, twice as long compared to plain samples. Altogether, chitosan increased the stability of microvesicles and is a suitable platform for drug accumulation. As a result, the chitosanphospholipid shell may enhance the theranostic potential of related microvesicles. However, the use of a fluorinated gas-core imposed an important restriction to stabilize submicrometric vesicles. Therefore, the second strategy was focused in developing a theranostic agent at the nanoscale by entrapping a liquid fluorinated core of perfluorohexane (PFH; C6F14) into a rigid polymeric shell of polylactide (PLA). To enhance the interaction of biodegradable polymers with perfluorocarbons, we synthesized PLA polymers containing five distinct lengths of fluorinated end-groups (from C3F7 until C13F27) by ring-opening polymerization of D,L-lactide. A greater extent of fluorous interactions was indicated by 19F spin-spin relaxation time and, subsequently, all the block copolymers were formulated into spherical nanocapsules (NC) with average diameter of 150 nm as verified by transmission electron microscopy. 19F-NMR showed that NC produced with fluorinated polymers increased two-fold the encapsulation efficiency of PFH compared with non-fluorinated derivatives. As a result, the NC echogenicity increased 10-fold for both fundamental and harmonic ultrasound imaging modalities. In addition, acoustic drop vaporization of PFH was successfully attained by focused ultrasound as observed by fragmented or disrupted morphologies in many samples. Effects of the fluorinated end-groups were further explored by a morphological evaluation of microcapsules (MC) produced with the polymers. Finally, both NC and MC present an interesting theranostic potential, being able to perform ultrasound-assisted diagnosis and potentially release drug contents when irradiated by high acoustic pressures.Résumé: Les composés fluorés sont très utilisés dans les agents de contraste ultrasonore (ACU) pour faciliter le diagnostic de nombreuses maladies par imagerie en temps réel. Tous les ACU commerciaux sont des microbulles de gaz perfluoré stabilisé par une monocouche de phospholipides, protéines ou tensioactifs. Cependant, l'application théranostique (de la contraction de thérapeutique et de diagnostic) de ces matériaux est sévèrement limitée par (i) la faible stabilité du composé fluoré, (ii) leur taille micrométrique et (iii) le manque de compartiments efficaces pour l'encapsulation d'un principe actif. Nous avons proposé deux stratégies différentes pour améliorer la stabilité du coeur fluoré et fournir simultanément des interfaces fonctionnelles pour l'encapsulation d'un principe actif. La première approche a consisté à intercaler le chitosane avec des phospholipides (DSPC) pour augmenter la stabilité de microvésicules contenant du gaz fluoré décafluorobutane (C4F10). L'affinité du DSPC et du chitosane a été révélée par des techniques de caractérisation de surface et par microscopie à fluorescence. Les microvésicules contenant du chitosane ont présenté des signaux intenses de la composante gazeuse en résonance magnétique nucléaire du fluor (RMN 19F) et en échographie in vitro après 48 h, deux fois plus longtemps que les échantillons sans chitosane. Le chitosane permet ainsi d'augmenter la stabilité des microvésicules et constitue une plateforme appropriée pour l'encapsulation de médicaments. La coque de chitosane-phospholipide pourrait donc améliorer le potentiel théranostique de ces microvésicules. Cependant, l'utilisation d'un coeur gazeux a rendu la stabilisation de vésicules submicrométriques difficile. Par conséquent, la deuxième stratégie s'est focalisée sur le développement d'un agent théranostique à l'échelle nanométrique en piégeant un coeur fluoré liquide de perfluorohexane (PFH; C6F14) dans une enveloppe polymère rigide de polylactide (PLA). Pour améliorer l'interaction des polymères biodégradables avec les perfluorocarbones, nous avons synthétisé des polymères PLA contenant cinq longueurs différentes de groupes terminaux fluorés (de C3F7 à C13F27) par polymérisation par ouverture de cycle du D,L-lactide. Les mesures de temps de relaxation spin-spin 19F ont démontré la présence d'interactions fluorophiles intenses entre les chaînons fluorés et le PFH. Les polymères ont ensuite été formulés en nanocapsules (NCs) sphériques de 150 nm de diamètre, comme vérifié par microscopie électronique en transmission. La RMN 19F a montré que l'efficacité d'encapsulation du PFH dans les capsules est doublée grâce à l'utilisation des polymères fluorés comparé aux dérivés non fluorés. Par conséquent, la réponse acoustique des NCs a été multipliée par dix avec les deux modes d'imagerie fondamentale et harmonique. En outre, l'utilisation d'ultrasons focalisés a permis la vaporisation acoustique de gouttelettes de PFH, confirmée par l'observation de morphologies fragmentées ou perturbées dans de nombreux échantillons. Les effets des groupes terminaux fluorés ont été davantage explorés par une évaluation morphologique des microcapsules (MCs) produites avec les polymères. Finalement, les NCs et MCs présentent un potentiel théranostique intéressant, puisqu'elles permettent d'effectuer un diagnostic assisté par ultrasons et de libérer potentiellement un principe actif lorsqu'elles sont soumises à des pressions acoustiques élevées

Desenvolvimento de filmes nanoestruturados pela técnica de layer-by-layer para controle de cinética de liberação proteica

Orientador : Prof. Dr. Roberto PontaroloCo-orientador : Prof. Dr. Rilton Alves de FreitasDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 08/03/2013Bibliografia : fls. 67-79Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: O desenvolvimento de um novo sistema de liberação de fármacos com base em membranas de celulose bacteriana (CB) revestidas com filmes nanoestruturados é apresentado. Neste trabalho, foi realizada a deposição de múltiplas camadas dos biopolímeros quitosana e alginato pela técnica de Layer-by-Layer (LbL) sobre membranas de CB modificadas quimicamente por carboxilação com o reagente 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (TEMPO). O processo de alteração da estrutura química das cadeias de celulose foi confirmado por análises de infravermelho e espectroscopia fotoeletrônica de raios X, ao passo que o estudo da interação da membrana modificada frente aos polímeros foi efetuado com o auxílio de filmes ultrafinos: modelos de CB modificados com reagente TEMPO foram submetidos ao processo de LbL sob acompanhamento em tempo real de microbalança de cristal de quartzo e elipsometria. Os ensaios revelaram que a superfície carboxilada é capaz de adsorver uma quantidade maior da camada inicial de quitosana (-105±1,5 Hz/ 14,1±0,8 nm) em comparação à interface de CB (-6,0±0,2 Hz/ 11,0±2,4 nm), além de permitir a formação de multicamadas mais espessas e com maior massa, comprovando que a modificação química lhe confere maior afinidade em relação aos polímeros. A deposição polimérica foi efetuada sobre as membranas por duas metodologias distintas de LbL, imersão e spray, e subsequentemente avaliadas por microscopia de força atômica e fluorescência confocal à laser. Os resultados exibiram a presença de pequenos agregados nodulares para a amostra nebulizada e uma deposição mais homogênea e regular para a membrana imersa nas soluções poliméricas, porém em ambas as amostras a adsorção ocorre sobre a superfície das fibras que compõe a membrana. Assim, é possível observar que a organização e arquitetura molecular diferem de acordo com a forma de interação, gerando recobrimentos com diferentes morfologias. Na última etapa do trabalho avaliou-se a capacidade da membrana modificada em interagir com a proteína fator de crescimento epidermal (EGF) através de adsorção em meio estático e liberá-la a partir de sistemas revestidos pelas metodologias de spray e imersão, compreendidas na técnica de LbL. Os resultados exibiram uma incorporação de 10,3±0,7% em 24 horas, revelando que a membrana apresenta uma grande capacidade de imobilização do EGF por um período de tempo prolongado de até 96 horas. Os ensaios de liberação exibiram uma liberação gradual da proteína em até 30 horas, de maneira que o grupo controle apresentou a liberação de mais de 85% do total incorporado, ao passo que as amostras revestidas atingiram um máximo de 25% no mesmo período de tempo avaliado. Portanto, um sistema capaz de carrear a proteína EGF e, simultaneamente, efetuar interações de natureza eletrostática com polímeros carregados opostamente foi descrito. O sistema gerado apresenta a capacidade de controlar a liberação do fármaco incorporado por um período prolongado de até 30 horas, apresentando grande utilidade para tratamento de queimaduras e processos de cicatrização.Abstract: The development of a new drug delivery system based on bacterial cellulose (BC) membranes coated with nanostructured films is reported. In this work we introduce a multilayer deposition of chitosan and alginate by the Layer-by-Layer (LbL) technique on modified BC membranes by carboxylation with 2,2,6,6- tetramethylpiperidinyl-1-oxyl (TEMPO) radical. Cellulose modification was confirmed by infrared analysis and X-ray photoelectron spectroscopy, whereas the evaluation of polymer interaction towards the modified membrane was performed with ultrathin films: TEMPO modified BC model films were submitted to LbL and the process was followed in real time by crystal quartz microbalance and ellipsometry, revealing that the carboxylated surface adsorbs an increased amount of chitosan as the first layer (- 105±1.5 Hz/ 14.1±0.8 nm) in comparison with BC interface (-6.0±0.2 Hz/ 11.0±2.4 nm), apart from enabling the build-up of greater and thicker multilayers that testifies the enhanced interaction provided by the chemical modification. LbL deposition onto membranes was performed by two distinct methodologies, dipping and spray, subsequently analyzed by atomic force microscopy and confocal laser scanning microscopy that revealed the presence of nodular aggregates for the sprayed sample, where a more regular and flat deposition for dipped samples though polymer adsorption occurs exclusively on top of membrane fibers. Therefore, it is possible to observe different molecular architectures and organizations degrees by LbL methodology, each leading to a flatter or greater deposition. In the last part of this work, we studied the modified membrane ability to interact with the protein epidermal growth factor (EGF) trough adsorption in a static medium and release through systems coated by the LbL technique of spray and dipping. Results exhibited the immobilization of approximately 10.3±0.7% of protein uptake in a prolonged period of time until 96 hours. Protein releasing experiments revealed a gradual protein release until the period of 30 hours. The control group lost more than 85% of total incorporated protein, while the coated samples reached a maximum release of 25% in the same time interval. Therefore we describe an EGF delivery system able to simultaneously interact with oppositely charged polyelectrolytes and releasing it in a sustainable manner that presents great applicability for burning and wound treatments

Long-term decomposition of aqueous S-nitrosoglutathione and S-nitroso-N-acetylcysteine: influence of concentration, temperature, pH and light

Primary S-nitrosothiols (RSNOs) have received significant attention for their ability to modulate NO signaling in many physiological and pathophysiological processes. Such actions and their potential pharmaceutical uses demand a better knowledge of their stability in aqueous solutions. Herein, we investigated the effects of concentration, temperature, pH, room light and metal ions on the long-term kinetic behavior of two representative primary RSNOs, S-nitrosoglutathione (GSNO) and S-nitroso-N-acetylcysteine (SNAC). The thermal decomposition of GSNO and SNAC were shown to be affected by the auto-catalytic action of the thiyl radicals. At 25 degrees C in the dark and protected from the catalytic action of metal ions, GSNO and SNAC solutions 1 mM showed half-lives of 49 and 76 days, and apparent activation energies of 84 +/- 14 and 90 +/- 6 kJ mol(-1), respectively. Both GSNO and SNAC exhibited increased stability in the pH range 5-7. At high pH the decomposition pathway of GSNO involves the formation of an intermediate (GS-NO22-), which decomposes generating GSH and nitrite. GSNO solutions displayed lower sensitivity to the catalytic action of metal ions than SNAC and the exposure to room light led to a 5-fold increase in the initial rates of decomposition of both RSNOs. In all comparisons, SNAC solutions showed higher stability than GSNO solutions. These findings provide strategic information about the stability of GSNO and SNAC and may open new perspectives for their use as experimental or therapeutic NO donors.843037FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa Do Estado De São Paulo07/55877-3; 07/50995-8; 17/19253-7; 16/02414-