Antibiotic-free selection in E. coli: new considerations for optimal design and improved production

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The increasing regulatory requirements to which biological agents are subjected will have a great impact in the field of industrial protein expression and production. There is an expectation that in a near future, there may be "zero tolerance" towards antibiotic-based selection and production systems. Besides the antibiotic itself, the antibiotic resistance gene is an important consideration. The complete absence of antibiotic-resistance gene being the only way to ensure that there is no propagation in the environment or transfer of resistance to pathogenic strains.</p> <p>Results</p> <p>In a first step, we have designed a series of vectors, containing a stabilization element allowing a complete elimination of antibiotics during fermentation. Vectors were further improved in order to include alternative selection means such as the well known poison/antidote stabilization system. Eventually we propose an elegant positive pressure of selection ensuring the elimination of the antibiotic-resistance gene through homologous recombination. In addition, we have shown that the presence of an antibiotic resistance gene can indirectly reduce the amount of expressed protein, since even in absence of selection pressure the gene would be transcribed and account for an additional stress for the host during the fermentation process.</p> <p>Conclusions</p> <p>We propose a general strategy combining plasmid stabilization and antibiotic-free selection. The proposed host/vector system, completely devoid of antibiotic resistance gene at the end of construction, has the additional advantage of improving recombinant protein expression and/or plasmid recovery.</p

Exploration du rôle oncogénique de la délétion de AHCYL2 dans le lymphome de la zone marginale splénique

Lymphomas represent a heterogeneous group of cancers, originating from the malignant transformation of mature lymphocytes. The improvement of patients’ treatment requires a better understanding of molecular mechanisms driving lymphomagenesis. Splenic Marginal Zone Lymphoma (SMZL) is a rare and incurable B cell lymphoma, and the mechanisms responsible for its development are still largely unknown. Among the different cytogenetic abnormalities identified in SMZL patients, the deletion of the long arm of chromosome 7 (7q32) is the most common. Its involvement in lymphomagenesis is not well established but this deletion is specific to SMZL, suggesting that this region might contain one or several tumor suppressor genes, whose deletion might promote SMZL development. From a cohort of SMZL patients, we defined a minimal deleted region of 10,6Mb in the 7q32 region, using aCGH. It includes the smallest common deleted region identified in the literature (2,7Mb) which comprises 38 coding genes. In one patient, who did not present any 7q deletion in conventional cytogenetic, we identified a microdeletion in the 7q32 region altering only one gene: AHCYL2 (S-adenosyl homocysteine hydrolase like 2). This gene encodes a homolog of AHCY, the enzyme involved in the methionine cycle for the hydrolysis of SAH into homocysteine, a precursor of the transsulfuration pathway. These metabolic processes participate directly in the control of oxidative stress and epigenetic regulation. We studied a cohort of 36 SMZL patients (among which ten of them had a 7q deletion). Transcriptomic (RNA-seq), epigenetic (ATAC-seq) and metabolomic analyses were performed in order to identified transcriptomic profiles, chromatin modifications or metabolic alterations that might allow us to differentiate SMZL patients with a 7q deletion from those without any deletion. These analyses confirmed that AHCYL2 is under-expressed in B cells with del7q. However, the data obtained did not help us differentiate two distinct groups by unsupervised principal component analyses, although the del7q patient group seemed to show a more homogenous distribution. The chromatin architecture is also very similar between the two groups. However, the levels of 2 metabolites of the methionine cycle and the transsulfuration pathway (homocysteine and glutathione) were significantly reduced in patients harboring a 7q deletion. By inhibiting AHCYL2’s expression with interference RNA in a fibroblastic model, we confirmed these results by a targeted metabolomic analysis. We also managed to establish a correlation between AHCYL2’s expression and the senescence process. Indeed, AHCYL2’s expression is increased at the transcriptomic and the proteomic levels when cells enter replicative senescence, or when cells are treated with a senescence-inducing drug, such as bleomycin. However, we did not manage to identify a causal link between these two processes. The hypothesis that AHCYL2’s expression might be controlled by the transcription factor p53 has been explored, but we did not successfully confirm it. To conclude, the AHCYL2 gene is a potential tumor suppressor gene, whose inactivation modify the metabolism by altering the level of homocysteine and glutathione. Its function in the regulation of oxidative stress and epigenetic mechanisms remains to be established.Les lymphomes constituent un groupe hétérogène de cancers provenant de la transformation maligne des lymphocytes. L’amélioration de la prise en charge thérapeutique nécessite une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la lymphomagenèse. Le lymphome de la zone marginale splénique (LZMS) est un lymphome B rare et incurable, dont les mécanismes de développement restent mal connus. Parmi les différentes anomalies cytogénétiques recensées chez les patients, la délétion hétérozygote d’une partie du bras long du chromosome 7 (7q32) est la plus fréquente. Quoique son rôle dans la lymphomagenèse soit mal établi, sa spécificité à ce type de cancer suggère que cette région pourrait contenir un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur, dont la délétion favoriserait le développement du LZMS. A partir d’une cohorte de patients atteints de LZMS, nous avons cherché à cartographier la région minimale de délétion par des études de CGH-array. Nous avons défini une portion délétée de 10,6Mb, comprenant la région minimale de délétion identifiée par la littérature (2,7Mb) qui contient 38 gènes codants. Chez un patient ne présentant pas de del7q en cytogénétique conventionnelle, nous avons identifié une micro-délétion somatique n’altérant qu'un seul gène de la région minimale de délétion : le gène AHCYL2 (S-adénosyl homocystéine hydrolase like 2). Ce gène est un homologue d’AHCY, une enzyme qui intervient dans le cycle de la méthionine et produit de l’homocystéine, un précurseur de la voie de la transsulfuration. Ces processus métaboliques interviennent directement dans le contrôle du stress oxydatif et les régulations épigénétiques. Nous avons étudié une cohorte de 36 patients atteints de LZMS (dont 10 avec une délétion en 7q). Des analyses transcriptomique (RNA-seq), épigénétique (ATAC-seq) et métabolomique ont été réalisées de manière à identifier des profils transcriptomiques, des modifications de la chromatine ou des altérations métaboliques qui permettraient de différencier les patients possédant une délétion 7q. Ces analyses ont confirmé qu’AHCYL2 est sous-exprimé dans les cellules B avec une del7q. Cependant, les données obtenues n’ont pas permis de ségréger deux groupes distincts par analyses en composantes principale non supervisée, bien que celui des patients del7q semble avoir une répartition plus homogène. De plus, l’architecture chromatinienne est très similaire entre les deux groupes de patients. En revanche, le niveau de deux métabolites du cycle de la méthionine et de la voie de la transsulfuration (l’homocystéine et le glutathion) est significativement diminué chez les patients avec une del7q. En inhibant l’expression d’AHCYL2 dans un modèle fibroblastique, nous avons confirmé ces résultats par une analyse en métabolomes ciblé. Nous avons aussi pu établir l’existence d’une corrélation entre le niveau d’expression d’AHCYL2 et le processus de sénescence. En effet, l’expression d’AHCYL2 augmente au niveau transcriptionnel et protéique lorsque les cellules entrent en sénescence réplicative, ou sont traitées avec un agent inducteur de la sénescence tel que la bléomycine. Cependant, nous n’avons pas pu définir un lien causal entre ces deux processus. L’hypothèse que l’expression d’AHCYL2 serait contrôlée par le facteur de transcription p53 a été explorée, sans que nous réussissions à la confirmer. En conclusion, le gène AHCYL2 est un suppresseur de tumeur potentiel dont l’inactivation modifie le métabolisme en agissant sur le niveau d’homocystéine et de glutathion. Son rôle dans le contrôle du stress oxydatif et les mécanismes épigénétiques reste à établir

Exploration du rôle oncogénique de la délétion de AHCYL2 dans le lymphome de la zone marginale splénique

Lymphomas represent a heterogeneous group of cancers, originating from the malignant transformation of mature lymphocytes. The improvement of patients’ treatment requires a better understanding of molecular mechanisms driving lymphomagenesis. Splenic Marginal Zone Lymphoma (SMZL) is a rare and incurable B cell lymphoma, and the mechanisms responsible for its development are still largely unknown. Among the different cytogenetic abnormalities identified in SMZL patients, the deletion of the long arm of chromosome 7 (7q32) is the most common. Its involvement in lymphomagenesis is not well established but this deletion is specific to SMZL, suggesting that this region might contain one or several tumor suppressor genes, whose deletion might promote SMZL development. From a cohort of SMZL patients, we defined a minimal deleted region of 10,6Mb in the 7q32 region, using aCGH. It includes the smallest common deleted region identified in the literature (2,7Mb) which comprises 38 coding genes. In one patient, who did not present any 7q deletion in conventional cytogenetic, we identified a microdeletion in the 7q32 region altering only one gene: AHCYL2 (S-adenosyl homocysteine hydrolase like 2). This gene encodes a homolog of AHCY, the enzyme involved in the methionine cycle for the hydrolysis of SAH into homocysteine, a precursor of the transsulfuration pathway. These metabolic processes participate directly in the control of oxidative stress and epigenetic regulation. We studied a cohort of 36 SMZL patients (among which ten of them had a 7q deletion). Transcriptomic (RNA-seq), epigenetic (ATAC-seq) and metabolomic analyses were performed in order to identified transcriptomic profiles, chromatin modifications or metabolic alterations that might allow us to differentiate SMZL patients with a 7q deletion from those without any deletion. These analyses confirmed that AHCYL2 is under-expressed in B cells with del7q. However, the data obtained did not help us differentiate two distinct groups by unsupervised principal component analyses, although the del7q patient group seemed to show a more homogenous distribution. The chromatin architecture is also very similar between the two groups. However, the levels of 2 metabolites of the methionine cycle and the transsulfuration pathway (homocysteine and glutathione) were significantly reduced in patients harboring a 7q deletion. By inhibiting AHCYL2’s expression with interference RNA in a fibroblastic model, we confirmed these results by a targeted metabolomic analysis. We also managed to establish a correlation between AHCYL2’s expression and the senescence process. Indeed, AHCYL2’s expression is increased at the transcriptomic and the proteomic levels when cells enter replicative senescence, or when cells are treated with a senescence-inducing drug, such as bleomycin. However, we did not manage to identify a causal link between these two processes. The hypothesis that AHCYL2’s expression might be controlled by the transcription factor p53 has been explored, but we did not successfully confirm it. To conclude, the AHCYL2 gene is a potential tumor suppressor gene, whose inactivation modify the metabolism by altering the level of homocysteine and glutathione. Its function in the regulation of oxidative stress and epigenetic mechanisms remains to be established.Les lymphomes constituent un groupe hétérogène de cancers provenant de la transformation maligne des lymphocytes. L’amélioration de la prise en charge thérapeutique nécessite une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la lymphomagenèse. Le lymphome de la zone marginale splénique (LZMS) est un lymphome B rare et incurable, dont les mécanismes de développement restent mal connus. Parmi les différentes anomalies cytogénétiques recensées chez les patients, la délétion hétérozygote d’une partie du bras long du chromosome 7 (7q32) est la plus fréquente. Quoique son rôle dans la lymphomagenèse soit mal établi, sa spécificité à ce type de cancer suggère que cette région pourrait contenir un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur, dont la délétion favoriserait le développement du LZMS. A partir d’une cohorte de patients atteints de LZMS, nous avons cherché à cartographier la région minimale de délétion par des études de CGH-array. Nous avons défini une portion délétée de 10,6Mb, comprenant la région minimale de délétion identifiée par la littérature (2,7Mb) qui contient 38 gènes codants. Chez un patient ne présentant pas de del7q en cytogénétique conventionnelle, nous avons identifié une micro-délétion somatique n’altérant qu'un seul gène de la région minimale de délétion : le gène AHCYL2 (S-adénosyl homocystéine hydrolase like 2). Ce gène est un homologue d’AHCY, une enzyme qui intervient dans le cycle de la méthionine et produit de l’homocystéine, un précurseur de la voie de la transsulfuration. Ces processus métaboliques interviennent directement dans le contrôle du stress oxydatif et les régulations épigénétiques. Nous avons étudié une cohorte de 36 patients atteints de LZMS (dont 10 avec une délétion en 7q). Des analyses transcriptomique (RNA-seq), épigénétique (ATAC-seq) et métabolomique ont été réalisées de manière à identifier des profils transcriptomiques, des modifications de la chromatine ou des altérations métaboliques qui permettraient de différencier les patients possédant une délétion 7q. Ces analyses ont confirmé qu’AHCYL2 est sous-exprimé dans les cellules B avec une del7q. Cependant, les données obtenues n’ont pas permis de ségréger deux groupes distincts par analyses en composantes principale non supervisée, bien que celui des patients del7q semble avoir une répartition plus homogène. De plus, l’architecture chromatinienne est très similaire entre les deux groupes de patients. En revanche, le niveau de deux métabolites du cycle de la méthionine et de la voie de la transsulfuration (l’homocystéine et le glutathion) est significativement diminué chez les patients avec une del7q. En inhibant l’expression d’AHCYL2 dans un modèle fibroblastique, nous avons confirmé ces résultats par une analyse en métabolomes ciblé. Nous avons aussi pu établir l’existence d’une corrélation entre le niveau d’expression d’AHCYL2 et le processus de sénescence. En effet, l’expression d’AHCYL2 augmente au niveau transcriptionnel et protéique lorsque les cellules entrent en sénescence réplicative, ou sont traitées avec un agent inducteur de la sénescence tel que la bléomycine. Cependant, nous n’avons pas pu définir un lien causal entre ces deux processus. L’hypothèse que l’expression d’AHCYL2 serait contrôlée par le facteur de transcription p53 a été explorée, sans que nous réussissions à la confirmer. En conclusion, le gène AHCYL2 est un suppresseur de tumeur potentiel dont l’inactivation modifie le métabolisme en agissant sur le niveau d’homocystéine et de glutathion. Son rôle dans le contrôle du stress oxydatif et les mécanismes épigénétiques reste à établir

Exploration du rôle oncogénique de la délétion de AHCYL2 dans le lymphome de la zone marginale splénique

Lymphomas represent a heterogeneous group of cancers, originating from the malignant transformation of mature lymphocytes. The improvement of patients’ treatment requires a better understanding of molecular mechanisms driving lymphomagenesis. Splenic Marginal Zone Lymphoma (SMZL) is a rare and incurable B cell lymphoma, and the mechanisms responsible for its development are still largely unknown. Among the different cytogenetic abnormalities identified in SMZL patients, the deletion of the long arm of chromosome 7 (7q32) is the most common. Its involvement in lymphomagenesis is not well established but this deletion is specific to SMZL, suggesting that this region might contain one or several tumor suppressor genes, whose deletion might promote SMZL development. From a cohort of SMZL patients, we defined a minimal deleted region of 10,6Mb in the 7q32 region, using aCGH. It includes the smallest common deleted region identified in the literature (2,7Mb) which comprises 38 coding genes. In one patient, who did not present any 7q deletion in conventional cytogenetic, we identified a microdeletion in the 7q32 region altering only one gene: AHCYL2 (S-adenosyl homocysteine hydrolase like 2). This gene encodes a homolog of AHCY, the enzyme involved in the methionine cycle for the hydrolysis of SAH into homocysteine, a precursor of the transsulfuration pathway. These metabolic processes participate directly in the control of oxidative stress and epigenetic regulation. We studied a cohort of 36 SMZL patients (among which ten of them had a 7q deletion). Transcriptomic (RNA-seq), epigenetic (ATAC-seq) and metabolomic analyses were performed in order to identified transcriptomic profiles, chromatin modifications or metabolic alterations that might allow us to differentiate SMZL patients with a 7q deletion from those without any deletion. These analyses confirmed that AHCYL2 is under-expressed in B cells with del7q. However, the data obtained did not help us differentiate two distinct groups by unsupervised principal component analyses, although the del7q patient group seemed to show a more homogenous distribution. The chromatin architecture is also very similar between the two groups. However, the levels of 2 metabolites of the methionine cycle and the transsulfuration pathway (homocysteine and glutathione) were significantly reduced in patients harboring a 7q deletion. By inhibiting AHCYL2’s expression with interference RNA in a fibroblastic model, we confirmed these results by a targeted metabolomic analysis. We also managed to establish a correlation between AHCYL2’s expression and the senescence process. Indeed, AHCYL2’s expression is increased at the transcriptomic and the proteomic levels when cells enter replicative senescence, or when cells are treated with a senescence-inducing drug, such as bleomycin. However, we did not manage to identify a causal link between these two processes. The hypothesis that AHCYL2’s expression might be controlled by the transcription factor p53 has been explored, but we did not successfully confirm it. To conclude, the AHCYL2 gene is a potential tumor suppressor gene, whose inactivation modify the metabolism by altering the level of homocysteine and glutathione. Its function in the regulation of oxidative stress and epigenetic mechanisms remains to be established.Les lymphomes constituent un groupe hétérogène de cancers provenant de la transformation maligne des lymphocytes. L’amélioration de la prise en charge thérapeutique nécessite une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la lymphomagenèse. Le lymphome de la zone marginale splénique (LZMS) est un lymphome B rare et incurable, dont les mécanismes de développement restent mal connus. Parmi les différentes anomalies cytogénétiques recensées chez les patients, la délétion hétérozygote d’une partie du bras long du chromosome 7 (7q32) est la plus fréquente. Quoique son rôle dans la lymphomagenèse soit mal établi, sa spécificité à ce type de cancer suggère que cette région pourrait contenir un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur, dont la délétion favoriserait le développement du LZMS. A partir d’une cohorte de patients atteints de LZMS, nous avons cherché à cartographier la région minimale de délétion par des études de CGH-array. Nous avons défini une portion délétée de 10,6Mb, comprenant la région minimale de délétion identifiée par la littérature (2,7Mb) qui contient 38 gènes codants. Chez un patient ne présentant pas de del7q en cytogénétique conventionnelle, nous avons identifié une micro-délétion somatique n’altérant qu'un seul gène de la région minimale de délétion : le gène AHCYL2 (S-adénosyl homocystéine hydrolase like 2). Ce gène est un homologue d’AHCY, une enzyme qui intervient dans le cycle de la méthionine et produit de l’homocystéine, un précurseur de la voie de la transsulfuration. Ces processus métaboliques interviennent directement dans le contrôle du stress oxydatif et les régulations épigénétiques. Nous avons étudié une cohorte de 36 patients atteints de LZMS (dont 10 avec une délétion en 7q). Des analyses transcriptomique (RNA-seq), épigénétique (ATAC-seq) et métabolomique ont été réalisées de manière à identifier des profils transcriptomiques, des modifications de la chromatine ou des altérations métaboliques qui permettraient de différencier les patients possédant une délétion 7q. Ces analyses ont confirmé qu’AHCYL2 est sous-exprimé dans les cellules B avec une del7q. Cependant, les données obtenues n’ont pas permis de ségréger deux groupes distincts par analyses en composantes principale non supervisée, bien que celui des patients del7q semble avoir une répartition plus homogène. De plus, l’architecture chromatinienne est très similaire entre les deux groupes de patients. En revanche, le niveau de deux métabolites du cycle de la méthionine et de la voie de la transsulfuration (l’homocystéine et le glutathion) est significativement diminué chez les patients avec une del7q. En inhibant l’expression d’AHCYL2 dans un modèle fibroblastique, nous avons confirmé ces résultats par une analyse en métabolomes ciblé. Nous avons aussi pu établir l’existence d’une corrélation entre le niveau d’expression d’AHCYL2 et le processus de sénescence. En effet, l’expression d’AHCYL2 augmente au niveau transcriptionnel et protéique lorsque les cellules entrent en sénescence réplicative, ou sont traitées avec un agent inducteur de la sénescence tel que la bléomycine. Cependant, nous n’avons pas pu définir un lien causal entre ces deux processus. L’hypothèse que l’expression d’AHCYL2 serait contrôlée par le facteur de transcription p53 a été explorée, sans que nous réussissions à la confirmer. En conclusion, le gène AHCYL2 est un suppresseur de tumeur potentiel dont l’inactivation modifie le métabolisme en agissant sur le niveau d’homocystéine et de glutathion. Son rôle dans le contrôle du stress oxydatif et les mécanismes épigénétiques reste à établir

Non-conventional expression systems for the production of vaccine proteins and immunotherapeutic molecules

The increasing demand for recombinant vaccine antigens or immunotherapeutic molecules calls into question the universality of current protein expression systems. Vaccine production can require relatively low amounts of expressed materials, but represents an extremely diverse category consisting of different target antigens with marked structural differences. In contrast, monoclonal antibodies, by definition share key molecular characteristics and require a production system capable of very large outputs, which drives the quest for highly efficient and cost-effective systems. In discussing expression systems, the primary assumption is that a universal production platform for vaccines and immunotherapeutics will unlikely exist. This review provides an overview of the evolution of traditional expression systems, including mammalian cells, yeast and E.coli, but also alternative systems such as other bacteria than E. coli, transgenic animals, insect cells, plants and microalgae, Tetrahymena thermophila, Leishmania tarentolae, filamentous fungi, cell free systems, and the incorporation of non-natural amino acids

CUDC-907 blocks multiple pro-survival signals and abrogates microenvironment protection in CLL.

CUDC-907, a dual PI3K/HDAC inhibitor, has been proposed to have therapeutic potential in hematopoietic malignancies. However, the molecular mechanisms of its effects in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) remain elusive. We show that CLL cells are sensitive to CUDC-907, even under conditions similar to the protective microenvironment of proliferation centres. CUDC-907 inhibited PI3K/AKT and HDAC activity, as expected, but also suppressed RAF/MEK/ERK and STAT3 signalling and reduced the expression of anti-apoptotic BCL-2 family proteins BCL-2, BCL-xL, and MCL-1. Moreover, CUDC-907 downregulated cytokines BAFF and APRIL and their receptors BAFFR, TACI, and BCMA, thus blocking BAFF-induced NF-κB signalling. T cell chemokines CCL3/4/17/22 and phosphorylation of CXCR4 were also reduced by CUDC-907. These data indicated that CUDC-907 abrogates different protective signals and suggested that it might sensitize CLL cells to other drugs. Indeed, combinations of low concentrations of CUDC-907 with inhibitors of BCL2, BTK, or the NF-κB pathway showed a potent synergistic effect. Our data indicate that, apart from its known functions, CUDC-907 blocks multiple pro-survival pathways to overcome microenvironment protection in CLL cells. This provides a rationale to evaluate the clinical relevance of CUDC-907 in combination therapies with other targeted inhibitors