Semiquantitative analysis of genetically modified maize and soybean in food

The aim of this study was to analyze quantitatively the presence of genetically modified organism in food with different composition and degree of processing. Total DNA was extracted by Dellaporta´s method and GMO analysis was performed using two consecutives PCR reactions with specie specific primers (IVR and LE), screening primers (35S) and transgen specific primers (CRY and EPSPS). The quantification within the sensitivity establish by the EU was possible only in some foods (ice-cream, flours, soybean isolates and concentrates, starch). Samples with high lipid content or subjected to intense thermal treatments (such as some snacks, mayonnaise, creamy soup) could not be amplified mainly due to the presence of PCR inhibitors. Therefore the method was adequate for identification of food as GM, within the limits establish by EU, only for some Argentine an commercial food products. These findings showed that the develop method was satisfactory only for simple food that were not subject to intense thermal treatments and that do not have high lipid content and that the main limitation of the method is DNA purity.Fil: Cazzola, María Laura. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaFil: Petruccelli, Silvana. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; Argentin

Crystallization of waxes in sunflowerseed oil: effects of an inhibitor

The mechanism of action of a commercial inhibitor on the crystallization of waxes present in sunflowerseed oil was analyzed. The results showed the inhibitor favored nucleation, leading to a decrease in the amount of waxes available for the growth of the crystals already formed. The inhibitor decreased the crystal size, increased the number of crystals and possibly caused slower crystallization of waxes.Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimento

Modificaciones estructurales de aislados proteicos de soja producidas por tratamientos reductores y térmicos y su relación con propiedades funcionales

Las propiedades funcionales de proteínas de soja han sido estudiadas fundamentalmente utilizando las fracciones 7S y 11S puras, poniéndose énfasis en las condiciones de gelación. Los estudios realizados con aislados proteicos de soja son escasos y se han llevado a cabo básicamente con aislados de origen comercial donde las condiciones de procesamiento se desconocen por lo que la información que puede obtenerse de los mismos es reducida. En el curso del presente trabajo se estudiarán, en primer lugar, los componentes proteicos que forman parte de un aislado obtenido a nivel de laboratorio. En segundo lugar se analizarán las modificaciones estructurales que sufren estos componentes al ser sometidos a tratamientos reductores y térmicos en distintas condiciones. Cabe señalar que hasta el momento sólo ha sido estudiado el efecto de tratamientos reductores sobre la funcionalidad de la glicinina pura. El efecto sobre la B-conglicinina y los aislados no ha sido considerado. Asimismo los estudios de asociación-disociación inducidos por calor de la glicinina, B-conglicinina y aislados proteicos se han realizado a pHs próximos a 7.6 y en condiciones controladas de fuerza iónica. Dichas condiciones no son representativas de las imperantes durante la elaboración de aislados. Por consiguiente, se estudiarán las reacciones de asociación-disociación que sufren los componentes del aislado cuando son sometidos a tratamientos térmicos en distintas condiciones durante el proceso de obtención. Finalmente se analizará el efecto de algunos de estos tratamientos reductores y térmicos sobre las características estructurales y funcionales de los aislados, con el fin de establecer relaciones entre tratamientos, modificaciones estructurales y funcionales.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).Facultad de Ciencias Exacta

Immunochemical reactivity of soybean β-conglycinin subunits

The immunochemical reactivity of two polyclonal sera raised against soybean purified αα' and β subunits was analysed. We show that anti-αα' serum mainly reacts with αα' subunits and β' subunit, but it does not recognize β subunit. In addition, β subunit is not able to compete with αα' subunit for anti-αα' serum recognition sites; therefore the main immunogenic region of αα' subunits is the extension region. Both anti-αα' and anti-β sera were able to recognize E. coli produced α subunit, consequently glycosylation is apparently not required for antigen-antibody interaction. Anti-β subunit serum shows strong reactivity against soybean produced β-subunit and recombinant α subunit, while it shows weak recognition of soybean purified αα' subunits. A mutant of α subunit with the N terminal β barrel region and C terminal α helices deleted, failed to be recognized by anti-β serum. For that reason although N and C terminal domains are structurally equivalent, their immunochemical reactivity is different.Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimento

Sunflower storage proteins are transported in dense vesicles that contain proteins homologous to the pumpkin vacuolar sorting receptor PV 72

Storage proteins are transported to a special storage compartments in seeds by Golgi dependent or independent pathways depending on the plant species. The aim of this work was to study the sunflower storage protein transport pathway and to identify component of the sorting machinery. Immature sunflower seeds were analyzed by subcellular fractionation (using percoll and sucrose gradients) and electron microscopy. The vesicles isolated with percoll, have precursors of 11S globulins, a-TIP, d-TIP, BiP, and two bands that have homology to the pumpkin vacuolar sorting receptor PV72. Sucrose isolated vesicles have the same composition than percoll ones, except for the lack of BiP and the presence of only one protein that has reactivity with pea VSR BP80. Electronic micrographies of developing seeds show that the formation of electron dense aggregates starts in the endoplasmic reticulum, and that these aggregates are very abundant in the trans-Golgi apparatus, where release of dense vesicles happens. These vesicles contain a homolog of PV72 in their membranes. Storage proteins are also detected in multivesicular bodies whose membranes have reactivity with PV72 serum. All these results indicated that sunflower storage proteins are transported to protein storage vacuoles by a Golgi dependent pathway in a process in which homologous of PV72 are involved.Fil: Contreras Molina, Maria Isabel. Michigan State University; Estados UnidosFil: Otegui, Marisa. University of Wisconsin; Estados UnidosFil: Petruccelli, Silvana. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; Argentin

Production of the main celiac disease autoantigen by transient expression in Nicotiana benthamiana

Celiac Disease (CD) is a gluten sensitive enteropathy that remains widely undiagnosed and implementation of massive screening tests is needed to reduce the long term complications associated to untreated CD. The main CD autoantigen, human tissue transglutaminase (TG2), is a challenge for the different expression systems available since its cross-linking activity affects cellular processes. Plant-based transient expression systems can be an alternative for the production of this protein. In this work, a transient expression system for the production of human TG2 in Nicotiana benthamiana leaves was optimized and reactivity of plant-produced TG2 in CD screening test was evaluated. First, a subcellular targeting strategy was tested. Cytosolic, secretory, endoplasmic reticulum (C-terminal SEKDEL fusion) and vacuolar (C-terminal KISIA fusion) TG2 versions were transiently expressed in leaves and recombinant protein yields were measured. ER-TG2 and vac-TG2 levels were 9- to 16-fold higher than their cytosolic and secretory counterparts. As second strategy, TG2 variants were co-expressed with a hydrophobic elastin-like polymer (ELP) construct encoding for 36 repeats of the pentapeptide VPGXG in which the guest residue X were V and F in ratio 8:1. Protein bodies (PB) were induced by the ELP, with a consequent two-fold-increase in accumulation of both ER-TG2 and vac-TG2. Subsequently, ER-TG2 and vac-TG2 were produced and purified using immobilized metal ion affinity chromatography. Plant purified ER-TG2 and vac-TG2 were recognized by three anti-TG2 monoclonal antibodies that bind different epitopes proving that plant-produced antigen has immunochemical characteristics similar to those of human TG2. Lastly, an ELISA was performed with sera of CD patients and healthy controls. Both vac-TG2 and ER-TG2 were positively recognized by IgA of CD patients while they were not recognized by serum from non-celiac controls. These results confirmed the usefulness of plant-produced TG2 to develop screening assays. In conclusion, the combination of subcellular sorting strategy with co-expression with a PB inducing construct was sufficient to increase TG2 protein yields. This type of approach could be extended to other problematic proteins, highlighting the advantages of plant based production platforms.Fil: Marin Viegas, Vanesa Soledad. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaFil: Acevedo, Gonzalo Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Bayardo, Mariela Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Chirdo, Fernando Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Petruccelli, Silvana. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; Argentin

The Major Soybean Allergen Gly m Bd 28K Induces Hypersensitivity Reactions in Mice Sensitized to Cow's Milk Proteins

Reactions to soy have been reported in a proportion of patients with IgE-mediated cow’s milk allergy (CMA). In this work, we analyzed if Gly m Bd 28K/P28, one of the major soybean allergens, is a cross-reactive allergen with cow milk proteins (CMP). We showed that P28 was recognized by IgE sera from CMA patients and activated human peripheral basophils degranulation. Moreover, IgE sera of mice exclusively sensitized to CMP recognized P28. Splenocytes from sensitized animals secreted IL-5 and IL-13 when incubated with CMP or soy proteins, but only IL-13 when treated with P28. In addition, a skin test was strongly positive for CMP and weakly positive for P28. Remarkably, milk-sensitized mice showed hypersensitivity symptoms following sublingual challenge with P28 or CMP. With the use of bioinformatics’ tools seven putative cross-reactive epitopes were identified. In conclusion, using in vitro and in vivo tests we demonstrated that P28 is a novel cross-reactive allergen with CMP.Fil: Candreva, Ángela María. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Smaldini, Paola Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Curciarello, Renata. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Fossati, Carlos Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Docena, Guillermo H.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Petruccelli, Silvana. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; Argentin

Semiquantitative analysis of genetically modified maize and soybean in food

The aim of this study was to analyze quantitatively the presence of genetically modified organism in food with different composition and degree of processing. Total DNA was extracted by Dellaporta's method and GMO analysis was performed using two consecutives PCR reactions with specie specific primers (IVR and LE), screening primers (35S) and transgen specific primers (CRY and EPSPS). The quantification within the sensitivity establish by the EU was possible only in some foods (ice-cream, flours, soybean isolates and concentrates, starch). Samples with high lipid content or subjected to intense thermal treatments (such as some snacks, mayonnaise, creamy soup) could not be amplified mainly due to the presence of PCR inhibitors. Therefore the method was adequate for identification of food as GM, within the limits establish by EU, only for some Argentinean commercial food products. These findings showed that the develop method was satisfactory only for simple food that were not subject to intense thermal treatments and that do not have high lipid content and that the main limitation of the method is DNA purity.Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimento

Vacuolar deposition of recombinant proteins in plant vegetative organs as a strategy to increase yields

Delivery of recombinant proteins to vegetative tissue vacuoles was considered inconvenient since this compartment was expected to be hydrolytic; nevertheless there is growing evidence that certain foreign proteins accumulate at high yields in vacuoles. For example avidin, cellulolytic enzymes, endolysin, and transglutaminases were produced at high yields when were sorted to leaf central vacuole avoiding the detrimental effect of these proteins on plant growth. Also, several secretory mammalian proteins such as collagen, α1-proteinase inhibitor, complement-5a, interleukin-6 and immunoglobulins accumulated at higher yields in leaf vacuoles than in the apoplast or cytosol. To reach this final destination, fusions to sequence specific vacuolar sorting signals (ssVSS) typical of proteases or proteinase inhibitors and/or Ct-VSS representative of storage proteins or plant lectins were used and both types of motifs were capable to increase accumulation. Importantly, the type of VSSs or position, either the N or C-terminus, did not alter protein stability, levels or pos-translational modifications. Vacuolar sorted glycoproteins had different type of oligosaccharides indicating that foreign proteins reached the vacuole by 2 different pathways: direct transport from the ER, bypassing the Golgi (high mannose oligosaccharides decorated proteins) or trafficking through the Golgi (Complex oligosaccharide containing proteins). In addition, some glycoproteins lacked of paucimannosidic oligosaccharides suggesting that vacuolar trimming of glycans did not occur. Enhanced accumulation of foreign proteins fused to VSS occurred in several plant species such as tobacco, Nicotiana benthamiana, sugarcane, tomato and in carrot and the obtained results were influenced by plant physiological state. Ten different foreign proteins fused to vacuolar sorting accumulated at higher levels than their apoplastic or cytosolic counterparts. For proteins with cytotoxic effects vacuolar sorted forms yields were superior than ER retained variants, but for other proteins the results were the opposite an there were also examples of similar levels for ER and vacuolar variants. In conclusion vacuolar sorting in vegetative tissues is a satisfactory strategy to enhance protein yields that can be used in several plant species.Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimento

Efecto de LEC2 sobre la expresión de proteínas heterólogas en hojas de Nicotiana benthamiana

Las plantas son el sistema más económico y seguro para la producción deproteínas farmacéuticas e industriales. Muchas de estas proteínas requieren deun procesamiento típico de la vía secretoria para alcanzar una conformaciónactiva y soluble. En sistemas como células de mamíferos y levaduras, la síntesisde proteínas foráneas en esta vía se encuentra limitada por la capacidad deplegamiento y transporte, utilizándose estrategias de ingeniería celular parasuperar estas limitaciones e incrementar los rendimientos. En células vegetaleseste tipo de estrategias no se han explorado. El objetivo de este trabajo fue evaluarel impacto del factor de transcripción LEC2, vinculado a la síntesis de reservas ensemillas, en la producción de proteínas foráneas en hojas. La hipótesis planteadaes que la expresión ectópica de LEC2 produciría cambios en el desarrollo de lavía secretoria conduciendo a mayores niveles de acumulación. Con este fin seutilizaron diferentes genes reporteros dirigidos por el promotor CaMV35S y el factor de transcripción LEC2 como efector que fueron introducidos en hojas deNicotiana benthamiana utilizando agrobacterias, comparándose los resultadosobtenidos con y sin efector. LEC2 no se une al promotor CaMV35S y los efectosobservados serían indirectos. Primero se estudió el impacto de LEC2 en lalocalización de marcadores fluorescentes de la vía secretoria mediantemicroscopía confocal de barrido láser (CLSM). GFP-HDEL (marcador del RetículoEndoplásmico, ER) y ST-GFP (marcador del Golgi) presentaron la mismalocalización en ambos casos, mientras que los marcadores de compartimientosprevacuolares (PVC), GFP-BP80, y vacuola, RFP-AFVY, son secretados enpresencia de LEC2, indicando una alteración post-Golgi del funcionamiento de lavía. Los análisis realizados por inmunoblot, mostraron que LEC2 produceaumentos de 2,5‐3,5 veces en la acumulación de proteínas retenidas en el ER yde 3‐6 veces para proteínas vacuolares. La presencia fluorescencia de GFP-BP80en el apoplasto llamó la atención ya que GFP suele ser inestable a pH ácido, porello se estudió el pH del apoplasto in vivo mediante CLSM en plantas deArabidopsis thaliana Apo-pHusion que expresan de forma estable el sensor de pHmRFP1?EGFP direccionado a apoplasto, observándose un aumento del pH enhojas infiltradas con LEC2 respecto a controles sin infiltrar o infiltrados con unvector vacío. Teniendo en cuenta que se ha informado que el apoplasto es uncompartimiento proteolítico se decidió evaluar la actividad proteolítica. Usandoazocaseína se evaluó la actividad de extractos de hojas de N. benthamianainfiltradas con un vector vacío o LEC2, obteniéndose valores de actividad del 50%y 25%, respectivamente, respecto a hojas sin infiltrar. En conclusión,demostramos que la expresión de LEC2 los niveles de acumulación de reporterosen la vía secretoria siendo una estrategia novedosa potencialmente aplicable tantopara plataformas de producción transitorias como estable.Fil: Ocampo, Carolina Gabriela. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaFil: Petruccelli, Silvana. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaXIII Simposio RedBio Argentina 2021: La Biotecnología como Solución a Desafíos Pasados, Presentes y FuturosArgentinaREDBIO Argentin