Surface chemistry and spectroscopy studies on 1,4-naphthoquinone in cell membrane models using Langmuir monolayers

Investigating the role of drugs whose pharmaceutical activity is associated with cell membranes is fundamental to comprehending the biochemical processes that occur on membrane surfaces. in this work, we examined the action of 1,4-naphthoquinone in lipid Langmuir monolayers at the air-water interface, which served as a model for half of a membrane, and investigated the molecular interactions involved with tensiometry and vibrational spectroscopy. the surface pressure-area isotherms exhibited a noticeable shift to a lower area in relation to 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) and 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DPPS) lipid monolayers, which indicated a disruption of the monolayer structure and solubilisation of the lipids towards the aqueous subphase. To better correlate to the action of this drug in biological membrane events, cell cultures that represented tumorigenic and non-tumorigenic cells were spread onto the air-water interface, and 1,4-naphthoquinone was then incorporated. While only slight changes were observed in the non-tumorigenic cells upon drug incorporation, significant changes were observed in the tumorigenic cells, on which the organisation of the Langmuir monolayers was disrupted as evidenced by tensiometry and vibrational spectroscopy. This work then shows that this drug interacts preferentially for specific surfaces. in simplified models, it has a higher effect for the negative charged DPPS rather than the zwitterionic DPPC; and for complex cell cultures, 1,4-naphthoquinone presents a more significant effect for that representing tumorigenic cells. (c) 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.Universidade Federal de São Paulo, Diadema, SP, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Diadema, SP, BrazilWeb of Scienc

Estudo da expressãode proteínas envolvidas nas vias de sinalização pl3k/akt e ras/erk em células endoteliais resistentes ao anoikis

The acquisition of cell death resistance induced by blocking adhesion to the substrate (anoikis resistance) is a hallmark of neoplastic transformation and a critica I step during the metastatic processo PI3K1AKT and Ras/ERK signaling pathways are directly related to the growth, proliferation and cell survival. Changes in these pathways can also lead to neoplastic transformation. Aiming to clarify the signaling pathways involved in the processes of cell transformation and anoikis, wild endothelial cells (EC) were subjected to transformation induced by blockade of adhesion to the substrate (adhEü) and studied in comparison with endothelial cells transfected with the EJ-ras oncogene (EJ-ras EC) in relation to: cell growth; apoptosis; invasiveness; expression and localization of proteins involved in PI3K/AKT and Ras/ERK pathways. Anoikis resistant cells show characteristics similar to tumorigenic cells: multilayer growth, loss of contact inhibition, tumorigenic capacity, a high invasive potential and a low rate of apoptosis. Treatment with the inhibitor LY294002 led to a decrease in cell growth and increased rates of apoptosis in ali cell types studied. In relation to proteins expression involved in PI3K1AKT and Ras/ERK signaling pathway, Adh-EC clones showed an increase in expression of PI3K, AKT, mTOR, Ras and ERK compared to wild type cells. The expression of these proteins was inhibited after treatment with the inhibitor LY294002 (PI3K, AKT, mTOR) and U0126 (Ras and ERK) in ali cell types. We also observed that the gene expression of PI3K and mTOR is increased and the gene expression of PTEN is decreased in the Adh-EC clones relative to wild type cells. These data suggest that the PI3K1AKT and Ras/ERK signaltng pathways are related to acquisition of resistance to anoikis in endothelial cells. ixA aquisição da resistência à morte celular induzida por bloqueio da adesão ao substrato (resistência ao anoikis) é uma característica da transformação neoplásica e um passo crítico durante o processo metastático. As vias de sinalização PI3K1AKT e Ras/ERK estão diretamente relacionadas com o crescimento, a proliferação e a sobrevivência celular. Alterações nessas vias também podem levar à transformação neoplásica. Buscando estudar as vias de sinalização celular envolvidas no processo de anoikis e nos processos de transformação celular, células endoteliais selvagens (EC) foram submetidas à transformação induzida pelo impedimento de adesão (Adh-EC) e estudadas comparando-se com células endoteliais transfectadas com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC) em relação: ao crescimento celular; à apoptose; à capacidade invasiva e à expressão e localização de proteínas envolvidas nas vias PI3K/AKT e Ras/ERK. As células resistentes ao anoikis apresentaram características similares às células tumorigênicas: crescimento em multicamadas, perda de inibição por contato, capacidade tumorigênica, diminuição da capacidade adesiva e resistência à apoptose. O tratamento com o inibidor LY294002 levou à uma diminuição no crescimento e um aumento nas taxas de apoptose em todos os tipos celulares estudados. Em relação à expressão de proteínas que participam das vias de sinalização PI3K1AKT e Ras/ERK, os clones Adh-EC apresentaram um aumento na expressão de PI3K, AKT, mTOR, Ras e ERK em relação às células selvagens. A expressão dessas proteínas foi inibida após tratamento com o inibidor LY294002 (PI3K, AKT, mTOR) e U01?6 (Ras e Erk) em todos os tipos celulares. Também observamos que a expressão gênica de PI3K e mTOR está aumentada e a expressão gênica de PTEN está diminuída nos clones Adh-EC em relação às células selvagens. Estes dados sugerem que as vias de sinalização PI3K/AKT e Ras/Erk estão relacionadas com a aquisição da resistência ao anoikis em células endoteliais. VIIIDados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016

Silenciamento gênico do sindecam-4 em células endoteliais resistentes ao anoikis

A resistência de células tumorais à morte celular por perda de adesão (anoikis) é uma das principais características celulares que contribuem para a progressão e metástase tumoral. Como um fenômeno funcional, a resistência ao anoikis é um importante evento dentro da cascata metastática, sendo um prérequisito para disseminação e colonização em sítios distantes. Entretanto, os mecanismos envolvidos na regulação da resistência ao anoikis ainda não estão completamente elucidados. Várias moléculas estão envolvidas nos processos de sobrevivência, adesão e proliferação celular, entre elas o sindecam-4, um proteoglicano de heparam sulfato (PGHS). Mudanças na expressão do sindecam-4 tem sido comumente encontradas em células tumorais, indicando o seu envolvimento no câncer. Assim, para analisar o papel deste proteoglicano em diferentes eventos como, proliferação, crescimento, controle do ciclo celular, adesão, apoptose, invasão celular e expressão de proteínas da via PI3K/AKT/mTOR realizamos o silenciamento gênico do sindecam-4 em células endoteliais resistentes ao anoikis utilizando a técnica de RNA de interferência (miRNA). Após o silenciamento gênico, observamos uma diminuição da expressão proteica e gênica do sindecam-4, acompanhada por uma redução do número de cadeias de heparam e condroitim sulfato no extrato celular e no meio de cultura. Os clones silenciados (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC) apresentaram maior incorporação de BrdU após estímulo com soro, indicando que estas células se tornaram dependentes dos fatores de crescimento para proliferar, e menor taxa de crescimento. Em relação ao controle do ciclo celular, observamos uma diminuição no número de células na fase S. A capacidade adesiva ao colágeno foi significativamente maior nos clones silenciados, bem como apresentaram maior taxa de apoptose e menor taxa invasiva quando comparadas à célula endotelial parental (Adh1-EC). Os dados obtidos são similares aos encontrados para as células endoteliais selvagens (EC). A expressão de AKT, mTOR e PTEN, também foi investigada. Após silenciamento gênico do sindecam-4, observamos diminuição na expressão dos genes que codificam essas proteínas. Essa diminuição gênica não foi acompanhada pela diminuição da expressão proteica, exceto mTOR que apresentou uma redução, porém não significativa. Esses resultados nos levam a acreditar que o silenciamento gênico do sindecam-4 reverteu o comportamento tumorigênico das células resistentes ao anoikis. Essas e outras descobertas sugerem que o sindecam-4 é adequado para a intervenção farmacológica, fazendo deste um alvo atraente para a terapia do câncer.The resistance of tumor cells to cell death by adhesion loss (anoikis) is a major cellular feature that contributes to tumor progression and metastasis. As a functional phenomenon, anoikis resistance is an important event in the metastatic cascade, a prerequisite for colonization and spread to distant sites. However, the mechanisms involved in anoikis regulation resistance are not fully elucidated. Various molecules are involved in the survival processes, cell adhesion and proliferation, including the syndecan-4, a heparan sulfate proteoglycan (PGHS). Changes in syndecan-4 expression have been commonly found in tumor cells, indicating their involvement in cancer. Therefore, to analyze the role of this proteoglycan in different events such as, proliferation, growth, cell cycle control, adhesion, apoptosis, cell invasion and protein expression of the PI3K/AKT/mTOR pathway we will perform the silencing of syndecan-4 in anoikis-resistant endothelial cells using the interference RNA technique (miRNA). After gene silencing, we observed a decrease in the protein and gene expression of syndecan-4, accompanied by a reduction in the number of heparan and chondroitin sulfate chains in the cell extract and culture medium. Silenced clones (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC) showed higher BrdU incorporation after serum stimulation, indicating that these cells became dependent on growth factors to proliferate, and lower growth rate. In relation to cell cycle control, we observed a decrease in the number of cells in the S phase. The adhesive capacity to collagen was significantly higher in the silenced clones, as well as presented a higher rate of apoptosis and a lower invasiveness when compared to the parental endothelial cells (Adh1 -EC). The data obtained are similar to the data found for wildtype endothelial cells (EC). The expression of AKT, mTOR and PTEN was also investigated. After syndecan-4 gene silencing, we observed a decrease in the expression of genes encoding these proteins. This gene decrease was not accompanied by decreased protein expression, except mTOR which showed a reduction, but not significant. These results lead us to believe that the syndecan-4 gene silencing reversed the tumorigenic behavior of anoikis-resistant cells. These and other findings suggest that syndecan-4 is suitable for pharmacological intervention, making it an attractive target for cancer therapy.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP