Altering compositional properties of viral genomes to design Llve-attenuated vaccines

Live-attenuated vaccines have been historically used to successfully prevent numerous diseases caused by a broad variety of RNA viruses due to their ability to elicit strong and perdurable immune-protective responses. In recent years, various strategies have been explored to achieve viral attenuation by rational genetic design rather than using classic and empirical approaches, based on successive passages in cell culture. A deeper understanding of evolutionary implications of distinct viral genomic compositional aspects, as well as substantial advances in synthetic biology technologies, have provided a framework to achieve new viral attenuation strategies. Herein, we will discuss different approaches that are currently applied to modify compositional features of viruses in order to develop novel live-attenuated vaccines.ANII: FCE_1_2019_1_156157ANII: FCE_1_2019_1_15593

Evaluation of SYBR Green real time PCR for detecting SARS-CoV-2 from clinical samples

The pandemic caused by SARS-CoV-2 has triggered an extraordinary collapse of healthcare systems and hundred thousand of deaths worldwide. Following the declaration of the outbreak as a Public Health Emergency of International Concern by the World Health Organization (WHO) on January 30th, 2020, it has become imperative to develop diagnostic tools to reliably detect the virus in infected patients. Several methods based on real time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) for the detection of SARS-CoV-2 genomic RNA have been developed. In addition, these methods have been recommended by the WHO for laboratory diagnosis. Since most of these protocols are based on the use of fluorogenic probes and one-step reagents (cDNA synthesis followed by PCR amplification in the same tube), these techniques can be difficult to perform given the limited supply of reagents in low- and middle-income countries. In order to develop an inexpensive SARS-CoV-2 detection protocol using available resources we evaluated the SYBR Green based detection of SARS-CoV-2 to establish a suitable assay. To do so, we adapted one of the WHO recommended TaqMan-based one-step real time PCR protocols (from the University of Hong Kong) to SYBR Green. Our results indicate that SYBR-Green detection of ORF1b-nsp14 target represents a reliable cost-effective alternative to increase the testing capacity.ANII: FCE_1_2019_1_156157ANII: FCE_1_2019_1_15593

One-year monitoring SARS-CoV-2 RNA surface contamination in hospitals reveals no correlation with organic material and negative pressure as a limiting factor for contamination

Understanding transmission routes of SARS-CoV-2 is crucial to establish effective interventions in healthcare institutions. Although the role of surface contamination in SARS-CoV-2 transmission has been controversial, fomites have been proposed as a contributing factor. Longitudinal studies about SARS-CoV-2 surface contamination in hospitals with different infrastructure (presence or absence of negative pressure systems) are needed to improve our understanding of their effectiveness on patient healthcare and to advance our knowledge about the viral spread. We performed a one-year longitudinal study to evaluate surface contamination with SARS-CoV-2 RNA in reference hospitals. These hospitals have to admit all COVID-19 patients from public health services that require hospitalization. Surfaces samples were molecular tested for SARS-CoV-2 RNA presence considering three factors: the dirtiness by measuring organic material, the circulation of a high transmissibility variant, and the presence or absence of negative pressure systems in hospitalized patients' rooms. Our results show that: (i) There is no correlation between the amount of organic material dirtiness and SARS-CoV-2 RNA detected on surfaces; (ii) SARS-CoV-2 high transmissible Gamma variant introduction significantly increased surface contamination; (iii) the hospital with negative pressure systems was associated with lower levels of SARS-CoV-2 surface contamination and, iv) most environmental samples recovered from contaminated surfaces were assigned as non-infectious. This study provides data gathered for one year about the surface contamination with SARS-CoV-2 RNA sampling hospital settings. Our results suggest that spatial dynamics of SARS-CoV-2 RNA contamination varies according with the type of SARS-CoV-2 genetic variant and the presence of negative pressure systems. In addition, we showed that there is no correlation between the amount of organic material dirtiness and the quantity of viral RNA detected in hospital settings. Our findings suggest that SARS CoV-2 RNA surface contamination monitoring might be useful for the understanding of SARS-CoV-2 dissemination with impact on hospital management and public health policies. This is of special relevance for the Latin-American region where ICU rooms with negative pressure are insufficient.Agencia Nacional de Investigación e Innovació

Early transcontinental import of SARS-CoV-2 variant of concern 202012/01 (B.1.1.7) from Europe to Uruguay

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) variant B.1.1.7 causes a more transmissible and apparently more severe disease. We report its early introduction from Europe to South America from a traveler who arrived in Uruguay from the United Kingdom, even before B.1.1.7 was recognized as a variant of concern. This highlights the risk of introduction of SARS-CoV-2 variants despite strict contingency protocols and underscores the need of improving real-time surveillance worldwide.ANII: POS_NAC_2018_1_15149

Genetic and evolutionary determinants of mutation rate in bacteriophage φX174

La mutación es la fuente última de variabilidad genética y por eso es fundamental en la evolución de los organismos. Aunque la variabilidad genética es necesaria para la adaptación, la mayoría de las mutaciones suelen ser deletéreas y por tanto tienden a reducir la eficacia biológica de las poblaciones debido al lastre genético. La teoría predice que, como consecuencia del equilibrio entre adaptación y lastre genético, debe existir un valor intermedio para la tasa de mutación que permita maximizar el éxito evolutivo, o tasa óptima de mutación. En general, los virus son uno de los modelos más usados en biología y en particular en biología evolutiva. Esto es debido a una serie de características como son: i) su pequeño tamaño genómico, que hace sencillo comprender las bases moleculares de su evolución y realizar modificaciones genéticas in vitro; ii) sus grandes tamaños poblacionales y su rápida tasa de crecimiento, que permiten cultivarlos fácilmente y realizar muchas réplicas independientes; y iii) sus elevadas tasas de mutación, que los hacen evolucionar rápidamente permitiéndonos estudiar la evolución en tiempo real. Las tasas de mutación virales varían entre 10–8 y 10–4 sustituciones por nucleótido por ronda de replicación (s/n/r) y dependen, en gran parte, de las enzimas implicadas en la replicación. Las ARN polimerasas ARN dependientes (RdRp) y las retrotranscriptasas (RT) presentan las mayores tasas de mutación descritas debido a la ausencia de actividad correctora de errores 3'exonucleasa, lo cual en parte explica que los virus que presentan estadios de ARN en su ciclo de infección tengan tasas de evolución más rápidas que los organismos con genoma de ADN. Sin embargo, hay otros procesos que pueden afectar la tasa de mutación tales como el mecanismo de replicación, la presencia de agentes oxidantes e incluso la introducción de mutaciones mediada por enzimas citidina desaminasas del hospedador de la familia APOBEC3, por citar algunos ejemplos. Pese a la variedad de factores que pueden modular la tasa de mutación, se ha observado que los organismos que poseen ADN como material genético, incluyendo los virus de ADN, las bacterias y los eucariotas unicelulares, presentan una tasa de mutación por genoma de alrededor de 0,003 sustituciones por genoma y ronda de replicación, lo cual implica que la tasa de mutación está inversamente relacionada con el tamaño del genoma. Esta relación entre tasa de mutación y tamaño genómico se conoce como regla de Drake. Por ejemplo, la mayoría de bacterias tienen tamaños genómicos superiores a 1000 kb y tasas de mutación menores que 10–9 s/n/r. Sin embargo, los bacteriófagos de ADN de cadena sencilla, como φX174 y m13, suelen tener unos tamaños genómicos de aproximadamente 6 kb y sus tasas de mutación son del orden de 10–6 s/n/r. El bacteriófago φX174 y otros virus de ADN de cadena sencilla son modelos interesantes para realizar estudios de tasas de mutación y adaptación debido a que sus tasas de mutación son de las más altas entre los virus de ADN y, además, estos virus utilizan la polimerasa del huésped para la replicación viral. Por tanto, el objetivo principal de esta tesis doctoral consistió en investigar los mecanismos de regulación de la tasa de mutación que no dependen de la polimerasa viral, utilizando el bacteriófago φX174 como sistema modelo. En un trabajo anterior (Domingo-Calap et al., 2012), demostramos que el bacteriófago φX174 desarrolló resistencia al análogo de nucleósido 5-fluorouracilo (5-FU) y que esta resistencia estaba mediada principalmente por sustituciones en el gen que codifica para la proteína de lisis E. Estos resultados nos permitieron plantear la hipótesis de que la acumulación de mutaciones en el genoma viral podría reducirse por cambios en el tiempo de lisis. Para ello, primero diseñamos y construimos una serie de mutantes que portaban remplazamientos del dominio N-terminal de la proteína E mediante mutagénesis dirigida y, a continuación, realizamos varios ensayos para caracterizar diferentes etapas del ciclo viral o rasgos de historia de vida (como, por ejemplo, el tamaño de la progenie, el tiempo de lisis, la tasa de crecimiento, entre otros) y la tasa de mutación de dichos mutantes y el virus silvestre. Los resultados de estos experimentos mostraron que aproximadamente la mitad de los mutantes ensayados producían un aumento en el tiempo de lisis, y dos de ellos (V2A y D8A) también producían resistencia al 5-FU. Los resultados mostraron que un retraso en el tiempo de lisis produjo un incremento del tamaño de la progenie en presencia de 5-FU, explicando el aumento de la eficacia biológica (medida como la tasa de crecimiento) en presencia del mutágeno. Además, estas mutaciones redujeron aproximadamente a la mitad la tasa de mutación comparado al virus silvestre según las estimaciones obtenidas a partir de pruebas de fluctuación en presencia de 5-FU. Finalmente, propusimos un modelo matemático sencillo que se ajusta a los datos observados y explica que un aumento de la progenie, como consecuencia de un mayor tiempo de lisis, permite al virus reducir el número de ciclos de infección necesarios para expandir su tamaño poblacional. En consecuencia, el número de ciclos de replicación en el cual las mutaciones pueden acumularse disminuye contrarrestando el efecto mutagénico del 5-FU y contribuyendo a la resistencia del virus. La tasa de mutación de φX174 sugiere que el fago evita los mecanismos de reparación post replicativos de E. coli, como el sistema de reparación de apareamientos incorrectos dependiente de la metilación del ADN (MMR por sus siglas en inglés). A diferencia de su hospedador, el fago φX174 no contiene sitios GATC, los cuales son necesarios para la acción del sistema MMR. En un estudio previo (Cuevas et al., 2011) encontramos que la introducción de siete sitios GATC produjo una reducción de treinta veces en la tasa de mutación. Además, el efecto sobre la tasa de mutación se anuló en células mutD, que son deficientes en MMR, indicando que el efecto de los sitios GATC estaba relacionado con la acción del sistema MMR. Para estudiar la relación entre el sistema MMR y la tasa de mutación de φX174 diseñamos y construimos una serie de mutantes en los cuales el variamos el número y localización de sitios GATC en el genoma viral, incluyendo un mutante poseyendo el número de sitios GATC esperados por azar. Esto nos permitió no solo estudiar el efecto la reparación de apareamientos incorrectos en la tasa de mutación del bacteriófago φX174 sino también como afecta a su capacidad adaptativa. Los resultados de las pruebas de fluctuación mostraron que la restauración del número de secuencias GATC esperadas por azar redujo aproximadamente ocho veces la tasa de mutación sin alterar significativamente la eficacia biológica del virus. Sin embargo, la eficiencia de la maquinaria implicada en la reparación del ADN fue limitada por los bajos niveles de metilación del genoma viral. Además, al construir diferentes virus mutantes, cambiando la localización y el número de sitios GATC introducidos, observamos que los efectos sobre la tasa de mutación no eran aditivos y eran muy variables, con algunas combinaciones que alcanzaban una reducción de 50 veces en la tasa de mutación, hasta algunas que no tenían un efecto significativo. Las mayores reducciones en la tasa de mutación se encontraron en algunos GATC localizados en regiones intergénicas, sugiriendo que los impedimentos estéricos pueden afectar a la acción de las enzimas de reparación. Por otro lado, también observamos que el efecto de la introducción de GATCs en el genoma de φX174 es revertido bajo condiciones de estrés, como son el crecimiento a elevadas temperaturas y la exposición a 5-FU, lo cual sugiere que la adición de secuencias GATC hace al fago sensible al fenómeno de mutagénesis inducida por el estrés. Mientras que a 42°C la tasa de mutación del virus silvestre no fue alterada de forma significativa, la tasa de mutación del virus 20GATC fue significativamente mayor que la de dicho virus a 37°C y también que la del virus silvestre a 42°C. De forma similar, el mutágeno tuvo un mayor efecto sobre la tasa de mutación del virus 20GATC comparado al virus silvestre. Con el fin de averiguar si la presencia de GATCs afecta a la capacidad evolutiva de φX174, realizamos experimentos de evolución experimental en condiciones constantes de baja y alta intensidad de selección. Para ello, primero realizamos 100 pases seriados en su hospedador natural, E. coli. Estas condiciones pretenden simular la intensidad de selección a la que naturalmente está expuesto φX174, al menos en nuestras condiciones de laboratorio. En segundo lugar, realizamos un nuevo experimento de evolución en un nuevo hospedador, Salmonella typhimurium, al cual φX174 no está adaptado y, por tanto, en el que las poblaciones virales estaban sometidas a una alta presión de selección. En ambos casos se evolucionaron cinco líneas independientes por virus y hospedador a partir de poblaciones ancestrales del virus silvestre y del mutante 20GATC. Mediante curvas de crecimiento estándar estimamos la eficacia biológica relativa a su correspondiente población ancestral. Los resultados de la evolución de las poblaciones derivadas del virus silvestre y del mutante 20GATC en E. coli mostraron similares trayectorias de la eficacia biológica a lo largo de la evolución. El análisis de las secuencias consenso de las poblaciones evolucionadas en E. coli reveló que la mayoría de los sitios GATC se habían mantenido, lo cual indica que, de haber una selección en contra de la presencia de sitios GATC, ésta es baja en nuestras condiciones experimentales. Por otro lado, también mostró que las poblaciones evolucionadas experimentaron un nivel de adaptación tras 100 pases de evolución en E. coli, aunque probablemente las diferencias en la eficacia de las mutaciones observadas fueron los suficientemente pequeñas para no poder detectarlas en nuestras condiciones de crecimiento. Sin embargo, en la evolución de las poblaciones derivadas del virus silvestre y del mutante 20GATC en S. typhimurium observamos que las poblaciones del mutante 20GATC mostraron una menor capacidad de adaptación, ya que el incremento de la eficacia fue menor que el observado en las poblaciones del virus silvestre, indicando que la presencia de GATCs constriñe la adaptabilidad del virus. El análisis de las secuencias consenso de las poblaciones evolucionadas en S. typhimurium mostró que el número de mutaciones observadas al final de la evolución fue similar en ambas poblaciones. Sin embargo, algunas mutaciones paralelas en el gen de la proteína H con un potencial efecto beneficioso, puesto que han sido previamente descritas en trabajos de adaptación a Salmonella, se encontraban exclusivamente en las poblaciones evolucionadas a partir del virus silvestre, lo cual proporciona una posible base molecular para explicar la menor capacidad adaptativa de las poblaciones derivadas del mutante 20GATC. En conclusión, los resultados obtenidos a partir de este trabajo contribuyen a dilucidar algunos mecanismos que permiten al bacteriófago φX174 regular su tasa de mutación para poder responder a las diferentes presiones de selección a las que puede estar sometido naturalmente

Tras la pista del VIH: los estudios evolutivos y la comprensión del sida.

El VIH o virus de la inmunodeficiencia humana tiene un gran impacto sanitario, social y económico; las terapias actuales permiten controlar la infección pero no se ha encontrado tratamiento curativo ni vacuna efectiva. Para conseguir estos objetivos, debe tenerse en cuenta la gran variabilidad genética y rápida evolución del VIH, asociadas, por ejemplo, a la aparición de variantes de resistencia a fármacos o de cambios antigénicos

Lamivudine/Adefovir Treatment Increases the Rate of Spontaneous Mutation of Hepatitis B Virus in Patients.

The high levels of genetic diversity shown by hepatitis B virus (HBV) are commonly attributed to the low fidelity of its polymerase. However, the rate of spontaneous mutation of human HBV in vivo is currently unknown. Here, based on the evolutionary principle that the population frequency of lethal mutations equals the rate at which they are produced, we have estimated the mutation rate of HBV in vivo by scoring premature stop codons in 621 publicly available, full-length, molecular clone sequences derived from patients. This yielded an estimate of 8.7 × 10-5 spontaneous mutations per nucleotide per cell infection in untreated patients, which should be taken as an upper limit estimate because PCR errors and/or lack of effective lethality may inflate observed mutation frequencies. We found that, in patients undergoing lamivudine/adefovir treatment, the HBV mutation rate was elevated by more than sixfold, revealing a mutagenic effect of this treatment. Genome-wide analysis of single-nucleotide polymorphisms indicated that lamivudine/adefovir treatment increases the fraction of A/T-to-G/C base substitutions, consistent with recent work showing similar effects of lamivudine in cellular DNA. Based on these data, the rate at which HBV produces new genetic variants in treated patients is similar to or even higher than in RNA viruses

Phylogenetic analysis of HBV sequences used in this study.

<p>A neighbor-joining containing the 621 full-length sequences used is shown. Patient names are as in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0163363#pone.0163363.t001" target="_blank">Table 1</a>. Sequences from untreated patients are marked in blue and those from treated patients in red. For each indicated patient, numbers show the bootstrap value of the node that delimitates the sequences from this patient. Sequences from patients N16 to N22 correspond to a study in which several family members were studied and are partially intermingled (not shown). Patients N13 and N14 are not shown because their sequences did not form well-defined monophyletic groups. Letters in the center of the tree indicate the viral genotype.</p

Summary of stop codons found in each HBV gene.

<p>Summary of stop codons found in each HBV gene.</p

HBV mutational spectrum in untreated patients and in patients undergoing lamivudine/adefovir treatment.

<p>The mutational spectrum was obtained in sequences derived from untreated (blue) or treated (red) patients by scoring all intra-patient SNPs along the HBV genome. Box plots indicate the relative contribution of each substitution type to the total SNPs found. Lower and upper box limits indicate percentiles 25^th and 75^th, respectively, and the middle line shows the median. Whiskers show the 10^th and 90^th percentiles, and outlying points are plotted individually. Differences between treated and untreated patients in the frequency of each substitution type were assessed by a Mann-Whitney non-parametric test (***: p < 0.001; **: 0.001 < p < 0.01; *: 0.01 < p < 0.05; ns: non-significant).</p