Desenvolvimento embrionário, visualização de pronúcleos e transferência pronuclear após centrifugação de zigotos bovinos em meio com citocalasina.

bitstream/CPPSE/17544/1/Boletim11.pdfISSN 1981-207

ANALYSIS OF VEGF GENE EXPRESSION IN PLACENTAS OF CLONED BOVINES, PRODUCED IN VITRO AND IN VIVO, BY SEMIQUANTITATIVE RT-PCR)

O sucesso da produção de embriões por fecundação in vitro ou transferência nuclear depende de uma variedade de fatores, dos quais a formação de uma incompleta vascularização placentária representa uma das principais causas de perda gestacional precoce. Neste trabalho, avaliou-se a expressão relativa de Fator de Crescimento Endotélio-vascular (VEGF), um potente agente vasculogênico, em placentas de bovinos clonados por transferência nuclear (NT), produzidos por fecundação in vitro (FIV), ou por monta natural (MN). Verificou-se um decréscimo altamente significativo de expressão de VEGF nas placentas dos animais produzidos in vitro, quando comparados aos animais MN (1,32a; 0,21b; 0,31b, respectivamente para MN, FIV e NT, p<0,05; teste de Duncan), sugerindo haver falha na reprogramação gênica, gerada tanto no sistema de cultivo, quanto na manipulação física de gametas e embriões, alterando o padrão de vascularização placentária e, portanto, ocasionando perdas gestacionais.metas 200

Efeito do protocolo de sincronização celular na produção de clones bovinos.

Os métodos de sincronização da célula doadora de núcleo para uso em clonagem baseiam-se no bloqueio reverslvel do ciclo celular em pontos especlficos. Idealmente, espera-se que esse bloqueio não provoque prejulzo à viabilidade do embrião reconstituldo após a transferência de núcleo. Este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência do processo de clonagem (taxa de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez) a partir de dois protocolos de sincronização celular: privação de soro fetal bovino (SFB) ou cultivo celular até confluência. Oócitos bovinos foram recuperados por aspiração folicular postmortem e maturados in vitro (MIV) por 18h em TCM-199 suplementado com 10% de SFB, 1 ug/mL FSH, 50ug/ mL hCG, 1 ug/mL estradiol, 0,2mM piruvato de sódio e 83,4~g/mL amicacina em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C. Oócitos apresentando extrusão do primeiro corpúsculo polar foram selecionados, corados com 10ug/mL de Hoechst 33342 e enucleados em fluido sintético de oviduto (SOF) tamponado com HEPES, suplementado com 10% de SFB e 7,5ug/mL de citocalasina B. A reconstituição oocitâria foi realizada com dois grupos de fibroblastos bovinos: Grupo A - cultivados sob privação de SFB por 3 a 5 dias (Dulbecco's Modified Eagle Medium -DMEM suplementado com 0,5% de SFB); ou Grupo B -cultivados até confluência (DMEM suplementado com 10% de SFB). Conjuntos citoplasto+fibroblasto foram eletrofundidos em solução de manitol 0,28M, com dois pulsos de corrente direta de 2,OKv/cm e duração de 20s cada. A ativação foi realizada por exposição à ionomicina (5 minutos, 5~M) seguida de incubação em SOF suplementado com 20mM cloreto de estrôncio e .\ O~g/mL de citocalasina B por 6 horas. Os provâveis zigotos foram co-cultivados com células da granulosa em SOF suplementado com 2,5% de SFB e 0,5% de BSA em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C por 7 dias. Alguns blastocistos de cada grupo foram transferidos para fêmeas receptoras previamente sincronizadas. As taxas de eletrofusão e produção de blastocistos dos dois grupos foram submetidas à ANOVA, com nlvel de significância de 5%. Houve diferença signiticativaentre os grupos A e B quanto às taxas de eletrofusão: 3,66o/a:!:137,% (549 fundido sem 1631 reconstituidos) contra 40,07% % 11,95% (696 fundidos em 1737 reconstituidos), respectivamente; e quanto ao desenvolvimento até blastocisto: 20,58% % 13,84% (113 blastocistos em 549) contra 34,77o/a:!:1 0,47% (242 blastocistos em 696), respectivamente. Tais diferenças proporcionaram produção média de 5,65 e 12,74 blastocistos por sessão de micromanipulação nos grupos A e B, respectivamente. No grupo A não foram diagnosticadas prenhezes aos 30 dias em 25 receptoras inovuladas; no grupo B foram diagnosticadas 4 gestações a partir de II inovulações (36,4%). Embora a privação de SFB permita o desenvolvimento a termo de clones bovinos (Campbell et al., Nature, 380:64, 1996), existem relatos de maior fragmentação de DNA após utilização da privação (Gibbons et aI., Biol Reprod, 66:895, 2002). Ainda, as menores taxas de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez observadas no grupo A em comparação ao B, indicam que o uso de fibrob'astos submetidos à privação de SFB não é justiticâvel para o procedimento de clonagem em bovinos

Expressão de DNA metiltransferases em blastocistos bovinos produzidos in vivo e in vitro.

Nos mamiferos, a metilação do DNA é essencial na regulação da expressão gênica e na diferenciação celular. Uma proporção elevada de embriões produzidos por transferência nuclear (TN) é incapaz de estabelecer e sustentar a gestação a termo. Há grande consenso que alterações epigenéticas, primariamente causadas por alterações nos padrões de metilação do DNA, resultam em expressão gênica anormal em embriões e fetos clonados, tomando os indices de sucesso da clonagem frustrantes. Este trabalho objetivou analisar os padrões de expressão das DNA metiltransferases (DNMT) I, 3A e 3B em blastocistos bovinos produzidos in vivo (grupo IV) ou in vilro por FIV (grupo FlV) e transferência nuclear a partir de fibroblastos submetidos à privação de soro fetal bovino (SFB) durante o cultivo (grupo TN-S), ou cultivados até a confluência (grupo TN-C). Uma vez que a linhagem celular doadora de núcleo era proveniente de uma fêmea, os blastocistos dos grupos IV e FIV foram sexados por PCR e somente aqueles do sexo feminino foram utilizados nas etapas posteriores. Após remoção da zona pelucida em PBS pH 2,5, os blastocistos foram individualmente submetidos a um ciclo de amplificação linear do RNA mensageiro utilizando o "Superscript RNA amplification system" (L-l 016, Invitrogen). A transcrição reversa de volume correspondente a I/IOdo RNA de um embrião foi realizada com 6,75JlM de hexâmeros randômicos e transcriptase reversa (Improm-lI Reverse Transcriptase, Promega) seguindo instruções do fabricante. Os ensaios de quantificação relativa dos transcritos dos genes DNMTI, DNMT3A e DNMT3B foram realizados por PCR em tempo real com sistema de detecção TaqMan* (Applied Biosystems); utilizando o gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) como controle endógeno. Foram utilizados oito embriões por grupo, amplificados em quadruplicata. A eficiência média das amplificações por PCR foi estimada para cada gene utilizando-se uma regressão linear do logaritmo da tluorescência a cada ciclo (Ramakers et aI., Neurosci. Lett., 339:62, 2003); e as razões de expressão calculadas de acordo com metodologia descrita por Livak e Schmittgen (Methods, 25:402, 2001). Para verificar as diferenças significativas foi utilizado o "Pair wise fixed reallocation randomization tes(' (Pfaffi et ai., Nucleic Acids Res., 30:e36. 2002). Todas as razões de expressão foram normalizadas pelo GAPDH e calibradas em função do grupo IV. Não foram detectados transcritos da DNMTI nos blastocistos do grupo TN-S, em contra partida. não se verificaram diferenças estatisticas (P>0,05) entre as razões de expressão dos grupos FIV (0,95) e TN-C (0,77). comparados ao grupo IV. Os grupos de transferência nuclear (TN-C e TN-S) apresentaram razões de expressão numericamente superiores para a DNMT3A (1,89 e 1,99; respectivamente) e para a DNMT3B (1,31 e 2,08; respectivamente) quando comparados aos grupos fertilizados (IV e FIV: 1,00 e 1,50 para DNMT3A; e 1,00 e 1,29 para DNMT3B; respectivamente). no entanto, sem diferenças significativas (P>0,05). A ausência de expressão da DNMTI no grupo TN com fibroblastos submetidos à privação de SFB nos leva a sugerir que embriões clonados a partir deste protocolo sejam menos viáveis do que aqueles oril,lndos de fibroblastos cultivados até confluência. A falta de DNMTl compromete a metilação do DNA a cada ciclo celular e toma os embriões inaptos a manterem as marcações epigcnéticas após cada mitose e sustentar o desenvolvimento fetal

Efeitos da substituição do soro fetal bovino (SFB) e da albumina sérica bovina (BSA) pela ovalbumina (OVA) na produção in vitro de embriões bovinos.

As biotecnologias aplicadas à reprodução animal vêm causando grandes impactos à produção animal, principalmente nas últimas duas décadas. Historicamente, o meio de cultivo contém SFB ou BSA, que são preparados e purificados a partir de produtos derivados sangUíneos e apresentam altos riscos de contaminação por patógenos, como vírus: BHV-I e BVDV (GUERIN et ai., Buli Academic Veterinarian France, v.61, po513-520, 1988), e prions: BSE (KRISHER et ai., Biology of Reproduction, v.60, p.1345-1352, 1999). De acordo com Barlian et ai. (Cell Biology Intemational, v.17, p.677-684, 1993), a OVA é um suplemento protéico não aparentado ao BSA, mas que -possui a capacidade de manter a proliferação celular. Além disso, por ser de origem heteróloga, os riscos de transmissão de doenças são menores. O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da substituição do SFB e do BSA pela OVA na PIV. Os oócitos foram maturados in vitro (MlV) em meio TCM 199 com sais de Earle, suplementado de acordo com os tratamentos: SFB (10% SFB; Crypion«», BSA (Inlab«>; 4mgimL BSA), OVA (Inlab«>; 4mg/mLOVA), e 1,0~gimL de FSH (Pluset>C, alier), 50ug/mL de hCG (Profasi«>,S erono), 1,0ug/mL de estradiol (Sigma E-2758), 0,2mM de piruvato de sódio e 83,4ugimL de amicacina, durante 24h à 38,5°C e atmosfera de 5% de CO2 em aro A fecundação in vitro (FIV) foi realizada após 24h de MIV, em meio TALP-FIV, com 0,2mM de piruvato, 83,4ugimL de amicacina e suplementado de acordo com os tratamentos: 6mgimL de BSA ou 6mgimL de OVAo Após o ténnino da incubação com os espennatozóides, os prováveis zigotos foram submetidos ao cultivo em meio SOF e suplementado de acordo com os tratamentos (SFB, BSA ou OVA), atmosfera com baixa tensão de O2 (5% de O" 5% de CO2 e 90% de NJ, umidade saturada, em câmara modular e mantida em incubadora de cultivo à 38,5C1Cd, urante 7 a 8 dias, para atingirem o estádio de blastocisto. Os tratamentos foram nomeados da seguinte maneira: a primeira letra referente à etapa de maturação, a segunda à fecundação, e a terceira ao cultivo. Para avaliação quantitativa, foram utilizados 2355 oócitos bovinos distribuídos entre sete grupos experimentais: CONT, SBS, SOS, BBB, BOB, 000 ou OBO, em cinco repetições. No total dos oócitos avaliados, 1795 (76,22%) clivaram, 646 (27,43% do total de oócitos) tomaram-se blastQcistos e 243 (10,32% do total de oócitos, ou 37,62% do total de blastocistos) eclodiram. A etapa de CIV pennitiu avaliar que os diferentes tratamentos foram semelhantes (p>0,05) quanto à taxa de clivagem. Entretanto, quanto à taxa de produção de blastocistos, o grupo 000 (26,0%) foi semelhante (p>0,05) aos grupos SOS (33,8%), BBB (35,8%), BOB (32%) e OBO (33%), mas foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (45%) e SBS (42,8%). Quanto à taxa de eclosão, o grupo 000 (20,4%), foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (46,2%), SBS (43,4%), SOS (38,4%), BBB (41,6%), e semelhante aos grupos BOB (28,2%) e OBO (25,4%). Apesar da redução na quantidade blastocistos produzidos, concluímos que é possível produzir in vitro embriões bovinos na ausência de SFB e/ou BSA

Oocyte activation and preimplantation development of bovine embryos obtained by specific inhibition of cyclin-dependent kinases.

Realizaram-se dois experimentos para avaliar a eficiência da bohemina e roscovitina associadas à ionomicina para ativação partenogenética e desenvolvimento embrionário inicial de bovinos. No primeiro, foram testadas diferentes concentrações (0, 50, 75 ou 100µM) e diferentes tempos de exposição (2, 4 ou 6 horas) à bohemina ou à roscovitina na ativação de oócitos bovinos maturados in vitro (MIV) pré-expostos à ionomicina. Os melhores tratamentos, bohemina 75µM e roscovitina 50µM, ambos por seis horas, foram utilizados no segundo experimento, no qual oócitos bovinos MIV foram expostos à ionomicina seguido ou não pelo tratamento com inibidores específicos das quinases dependentes de ciclina (CDKI), e avaliados quanto à configuração nuclear, taxa de ativação e desenvolvimento até blastocisto. Os tratamentos combinados (ionomicina+CDKI) apresentaram melhor taxa de ativação (77,3%) e desenvolvimento embrionário inicial (35,2%) do que a ionomicina sozinha (69,4% e 21,9%, respectivamente), e também promoveram ativação mais uniforme (aproximadamente 90% de formação de um pronúcleo). Estes resultados demonstram que os CDKIs potencializam o efeito da ionomicina na ativação e desenvolvimento embrionário inicial e podem auxiliar na obtenção de protocolos de ativação mais eficientes, aumentando a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos por meio de biotécnicas reprodutivas

Gene expression in placentation of farm animals: An overview of gene function during development

AbstractEutherian mammals share a common ancestor that evolved into two main placental types, i.e., hemotrophic (e.g., human and mouse) and histiotrophic (e.g., farm animals), which differ in invasiveness. Pregnancies initiated with assisted reproductive techniques (ART) in farm animals are at increased risk of failure; these losses were associated with placental defects, perhaps due to altered gene expression. Developmentally regulated genes in the placenta seem highly phylogenetically conserved, whereas those expressed later in pregnancy are more species-specific. To elucidate differences between hemotrophic and epitheliochorial placentae, gene expression data were compiled from microarray studies of bovine placental tissues at various stages of pregnancy. Moreover, an in silico subtractive library was constructed based on homology of bovine genes to the database of zebrafish — a nonplacental vertebrate. In addition, the list of placental preferentially expressed genes for the human and mouse were collected using bioinformatics tools (Tissue-specific Gene Expression and Regulation [TiGER] — for humans, and tissue-specific genes database (TiSGeD) — for mice and humans). Humans, mice, and cattle shared 93 genes expressed in their placentae. Most of these were related to immune function (based on analysis of gene ontology). Cattle and women shared expression of 23 genes, mostly related to hormonal activity, whereas mice and women shared 16 genes (primarily sexual differentiation and glycoprotein biology). Because the number of genes expressed by the placentae of both cattle and mice were similar (based on cluster analysis), we concluded that both cattle and mice were suitable models to study the biology of the human placenta

Minimizing inter-genotypic competition effects to predict genetic values and selection in forestry genetic tests

The effect of competition is an important source of variation in breeding experiments. This study aimed to compare the selection of plants of open-pollinated families of Eucalyptus with and without the use of competition covariables. Genetic values were determined for each family and tree and for the traits height, diameter at breast height and timber volume in a randomized block design, resulting in the variance components, genetic parameters, selection gains, effective size and selection coincidence, with and without the use of covariables. Intergenotypic competition is an important factor of environmental variation. The use of competition covariables generally reduces the estimates of variance components and influences genetic gains in the studied traits. Intergenotypic competition biases the selection of open-pollinated eucalypt progenies, and can result in an erroneous choice of superior genotypes; the inclusion of covariables in the model reduces this influence