Nos mamiferos, a metilação do DNA é essencial na regulação da expressão gênica e na diferenciação celular. Uma proporção elevada de embriões produzidos por transferência nuclear (TN) é incapaz de estabelecer e sustentar a gestação a termo. Há grande consenso que alterações epigenéticas, primariamente causadas por alterações nos padrões de metilação do DNA, resultam em expressão gênica anormal em embriões e fetos clonados, tomando os indices de sucesso da clonagem frustrantes. Este trabalho objetivou analisar os padrões de expressão das DNA metiltransferases (DNMT) I, 3A e 3B em blastocistos bovinos produzidos in vivo (grupo IV) ou in vilro por FIV (grupo FlV) e transferência nuclear a partir de fibroblastos submetidos à privação de soro fetal bovino (SFB) durante o cultivo (grupo TN-S), ou cultivados até a confluência (grupo TN-C). Uma vez que a linhagem celular doadora de núcleo era proveniente de uma fêmea, os blastocistos dos grupos IV e FIV foram sexados por PCR e somente aqueles do sexo feminino foram utilizados nas etapas posteriores. Após remoção da zona pelucida em PBS pH 2,5, os blastocistos foram individualmente submetidos a um ciclo de amplificação linear do RNA mensageiro utilizando o "Superscript RNA amplification system" (L-l 016, Invitrogen). A transcrição reversa de volume correspondente a I/IOdo RNA de um embrião foi realizada com 6,75JlM de hexâmeros randômicos e transcriptase reversa (Improm-lI Reverse Transcriptase, Promega) seguindo instruções do fabricante. Os ensaios de quantificação relativa dos transcritos dos genes DNMTI, DNMT3A e DNMT3B foram realizados por PCR em tempo real com sistema de detecção TaqMan* (Applied Biosystems); utilizando o gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) como controle endógeno. Foram utilizados oito embriões por grupo, amplificados em quadruplicata. A eficiência média das amplificações por PCR foi estimada para cada gene utilizando-se uma regressão linear do logaritmo da tluorescência a cada ciclo (Ramakers et aI., Neurosci. Lett., 339:62, 2003); e as razões de expressão calculadas de acordo com metodologia descrita por Livak e Schmittgen (Methods, 25:402, 2001). Para verificar as diferenças significativas foi utilizado o "Pair wise fixed reallocation randomization tes(' (Pfaffi et ai., Nucleic Acids Res., 30:e36. 2002). Todas as razões de expressão foram normalizadas pelo GAPDH e calibradas em função do grupo IV. Não foram detectados transcritos da DNMTI nos blastocistos do grupo TN-S, em contra partida. não se verificaram diferenças estatisticas (P>0,05) entre as razões de expressão dos grupos FIV (0,95) e TN-C (0,77). comparados ao grupo IV. Os grupos de transferência nuclear (TN-C e TN-S) apresentaram razões de expressão numericamente superiores para a DNMT3A (1,89 e 1,99; respectivamente) e para a DNMT3B (1,31 e 2,08; respectivamente) quando comparados aos grupos fertilizados (IV e FIV: 1,00 e 1,50 para DNMT3A; e 1,00 e 1,29 para DNMT3B; respectivamente). no entanto, sem diferenças significativas (P>0,05). A ausência de expressão da DNMTI no grupo TN com fibroblastos submetidos à privação de SFB nos leva a sugerir que embriões clonados a partir deste protocolo sejam menos viáveis do que aqueles oril,lndos de fibroblastos cultivados até confluência. A falta de DNMTl compromete a metilação do DNA a cada ciclo celular e toma os embriões inaptos a manterem as marcações epigcnéticas após cada mitose e sustentar o desenvolvimento fetal
