A gp41 MPER-specific llama VHH requires a hydrophobic CDR3 for neutralization but not for antigen recognition

The membrane proximal external region (MPER) of the HIV-1 glycoprotein gp41 is targeted by the broadly neutralizing antibodies 2F5 and 4E10. To date, no immunization regimen in animals or humans has produced HIV-1 neutralizing MPER-specific antibodies. We immunized llamas with gp41-MPER proteoliposomes and selected a MPER-specific single chain antibody (VHH), 2H10, whose epitope overlaps with that of mAb 2F5. Bi-2H10, a bivalent form of 2H10, which displayed an approximately 20-fold increased affinity compared to the monovalent 2H10, neutralized various sensitive and resistant HIV-1 strains, as well as SHIV strains in TZM-bl cells. X-ray and NMR analyses combined with mutagenesis and modeling revealed that 2H10 recognizes its gp41 epitope in a helical conformation. Notably, tryptophan 100 at the tip of the long CDR3 is not required for gp41 interaction but essential for neutralization. Thus bi-2H10 is an anti-MPER antibody generated by immunization that requires hydrophobic CDR3 determinants in addition to epitope recognition for neutralization similar to the mode of neutralization employed by mAbs 2F5 and 4E10

Caractérisation structurale et fonctionnelle de PBP1b de Streptococcus pneumoniae et son implication dans la découverte de nouveaux inhibiteurs

Streptococcus pneumoniae, a major pathogen of the upper respiratory tract, is often found to be resistant to ?-lactam antibiotics, drugs which are commonly used in pneumococcal associated infections. The targets of these antibiotics are enzymes involved in bacterial peptidoglycan biosynthesis, the Penicillin-Binding Proteins (PBPs), whose active site structure is modified in resistant strains. In this work we present first the high resolution crystal structure of PBP1b, one of the three bifunctional pneumococcal PBPs, which revealed a structural reorganization of the active site as a consequence of its interaction with a pseudo-substrate of the reaction. This result led us to suggest that the active site opening plays a key role during the cell division process. Then, we solved the structures of complexes between PBP1b and various inhibitors, which can facilitate the process of rational drug-design. Finally, we characterized the glycosyltransferase domain of PBP1b, representing a new molecular target for drug development, by small angle X-ray scattering (SAXS). This original approach allowed us to provide a model concerning the organization and folding of this domain of this vital class of enzymes.Streptococcus pneumoniae, pathogène majeur de la sphère oro-pharyngée, résiste fréquemment aux antibiotiques de la famille des ?-lactamines généralement administrés dans les infections associées à ce pathogène. Les cibles de ces antibiotiques sont des enzymes responsables de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien, les Penicillin-Binding Proteins (PBP) dont la structure du site actif est modifiée dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques. Dans un premier temps, la résolution de la structure à haute résolution par cristallographie des rayons X de PBP1b, une des trois PBP bifonctionnelles du pneumocoque, a mis en évidence un phénomène de réorganisation structurale du site actif de la molécule en fonction de son interaction avec un pseudo-substrat de la réaction. Ce résultat nous a permis de proposer que l'ouverture du site actif joue un rôle clef lors du processus de division cellulaire. Dans un deuxième temps, nous avons résolu les structures de complexes entre PBP1b et de nouvelles molécules inhibitrices, ce qui permet d'ouvrir la voie de la mise au point rationnelle de nouveaux médicaments. Pour finir, nous avons caractérisé le domaine glycosyltransférase de PBP1b ,qui représente une nouvelle cible moléculaire pour le développement de nouveaux antibactériens, notamment par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Cette approche originale nous a permis de proposer un modèle d'organisation et de repliement de ce domaine au sein de ces protéines

Caractérisation structurale et fonctionnelle de PBP1b de Streptococcus pneumoniae et son implication dans la découverte de nouveaux inhibiteurs

Streptococcus pneumoniae, a major pathogen of the upper respiratory tract, is often found to be resistant to ?-lactam antibiotics, drugs which are commonly used in pneumococcal associated infections. The targets of these antibiotics are enzymes involved in bacterial peptidoglycan biosynthesis, the Penicillin-Binding Proteins (PBPs), whose active site structure is modified in resistant strains. In this work we present first the high resolution crystal structure of PBP1b, one of the three bifunctional pneumococcal PBPs, which revealed a structural reorganization of the active site as a consequence of its interaction with a pseudo-substrate of the reaction. This result led us to suggest that the active site opening plays a key role during the cell division process. Then, we solved the structures of complexes between PBP1b and various inhibitors, which can facilitate the process of rational drug-design. Finally, we characterized the glycosyltransferase domain of PBP1b, representing a new molecular target for drug development, by small angle X-ray scattering (SAXS). This original approach allowed us to provide a model concerning the organization and folding of this domain of this vital class of enzymes.Streptococcus pneumoniae, pathogène majeur de la sphère oro-pharyngée, résiste fréquemment aux antibiotiques de la famille des ?-lactamines généralement administrés dans les infections associées à ce pathogène. Les cibles de ces antibiotiques sont des enzymes responsables de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien, les Penicillin-Binding Proteins (PBP) dont la structure du site actif est modifiée dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques. Dans un premier temps, la résolution de la structure à haute résolution par cristallographie des rayons X de PBP1b, une des trois PBP bifonctionnelles du pneumocoque, a mis en évidence un phénomène de réorganisation structurale du site actif de la molécule en fonction de son interaction avec un pseudo-substrat de la réaction. Ce résultat nous a permis de proposer que l'ouverture du site actif joue un rôle clef lors du processus de division cellulaire. Dans un deuxième temps, nous avons résolu les structures de complexes entre PBP1b et de nouvelles molécules inhibitrices, ce qui permet d'ouvrir la voie de la mise au point rationnelle de nouveaux médicaments. Pour finir, nous avons caractérisé le domaine glycosyltransférase de PBP1b ,qui représente une nouvelle cible moléculaire pour le développement de nouveaux antibactériens, notamment par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Cette approche originale nous a permis de proposer un modèle d'organisation et de repliement de ce domaine au sein de ces protéines

Approche structurale des interactions hôtes-pathogènes : Cas de facteurs de virulence et toxines bactériennes

Ce manuscrit a pour but de retracer mes expériences de recherche depuis la thèse jusqu’aux projets de recherche que je mène depuis mon recrutement en tant que chercheur au CNRS en 2011. J’ai effectué la quasi-totalité de mon parcours académique à Grenoble avec une incursion aux États-Unis pour un stage postdoctoral de deux ans et demi après la thèse.Mon parcours scientifique a également été assez linéaire puisque je m’intéresse depuis maintenant près de 20 ans à la biologie structurale des molécules d’intérêt biomédical. Les sujets biologiques ont quelque peu varié en fonction des postes que j’ai occupés, en passant par l’étude de protéines bactériennes ou bien des protéines humaines impliquées dans la restriction de virus pathogènes. Dans tous les cas, mon intérêt pour les interactions entre le pathogène et son hôte m’a conduite à graduellement augmenter la taille des protéines ou des complexes que j’ai étudiés m’amenant à explorer différentes techniques de biologie structurale en commençant par la cristallographie des rayons X, la diffusion des rayons X aux petits angles et maintenant la microscopie électronique que j’espère utiliser de plus en plus dans les années à venir

Approche structurale des interactions hôtes-pathogènes : Cas de facteurs de virulence et toxines bactériennes

Ce manuscrit a pour but de retracer mes expériences de recherche depuis la thèse jusqu’aux projets de recherche que je mène depuis mon recrutement en tant que chercheur au CNRS en 2011. J’ai effectué la quasi-totalité de mon parcours académique à Grenoble avec une incursion aux États-Unis pour un stage postdoctoral de deux ans et demi après la thèse.Mon parcours scientifique a également été assez linéaire puisque je m’intéresse depuis maintenant près de 20 ans à la biologie structurale des molécules d’intérêt biomédical. Les sujets biologiques ont quelque peu varié en fonction des postes que j’ai occupés, en passant par l’étude de protéines bactériennes ou bien des protéines humaines impliquées dans la restriction de virus pathogènes. Dans tous les cas, mon intérêt pour les interactions entre le pathogène et son hôte m’a conduite à graduellement augmenter la taille des protéines ou des complexes que j’ai étudiés m’amenant à explorer différentes techniques de biologie structurale en commençant par la cristallographie des rayons X, la diffusion des rayons X aux petits angles et maintenant la microscopie électronique que j’espère utiliser de plus en plus dans les années à venir

Approche structurale des interactions hôtes-pathogènes : Cas de facteurs de virulence et toxines bactériennes

Ce manuscrit a pour but de retracer mes expériences de recherche depuis la thèse jusqu’aux projets de recherche que je mène depuis mon recrutement en tant que chercheur au CNRS en 2011. J’ai effectué la quasi-totalité de mon parcours académique à Grenoble avec une incursion aux États-Unis pour un stage postdoctoral de deux ans et demi après la thèse.Mon parcours scientifique a également été assez linéaire puisque je m’intéresse depuis maintenant près de 20 ans à la biologie structurale des molécules d’intérêt biomédical. Les sujets biologiques ont quelque peu varié en fonction des postes que j’ai occupés, en passant par l’étude de protéines bactériennes ou bien des protéines humaines impliquées dans la restriction de virus pathogènes. Dans tous les cas, mon intérêt pour les interactions entre le pathogène et son hôte m’a conduite à graduellement augmenter la taille des protéines ou des complexes que j’ai étudiés m’amenant à explorer différentes techniques de biologie structurale en commençant par la cristallographie des rayons X, la diffusion des rayons X aux petits angles et maintenant la microscopie électronique que j’espère utiliser de plus en plus dans les années à venir

Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance

International audienc

The inherent flexibility of type I non-ribosomal peptide synthetase multienzymes drives their catalytic activities

International audienceNon-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) are multienzymes that produce complex natural metabolites with many applications in medicine and agriculture. They are composed of numerous catalytic domains that elongate and chemically modify amino acid substrates or derivatives and of non-catalytic carrier protein domains that can tether and shuttle the growing products to the different catalytic domains. The intrinsic flexibility of NRPSs permits conformational rearrangements that are required to allow interactions between catalytic and carrier protein domains. Their large size coupled to this flexibility renders these multi-domain proteins very challenging for structural characterization. Here, we summarize recent studies that offer structural views of multi-domain NRPSs in various catalytically relevant conformations, thus providing an increased comprehension of their catalytic cycle. A better structural understanding of these multienzymes provides novel perspectives for their re-engineering to synthesize new bioactive metabolites

Caractérisation structurale et fonctionnelle de PBP1b de Streptococcus pneumoniae et son implication dans la découverte de nouveaux inhibiteurs

Streptococcus pneumoniae, pathogène majeur de la sphère oro-pharyngée, résiste fréquemment aux antibiotiques de la famille des ?-lactamines généralement administrés dans les infections associées à ce pathogène. Les cibles de ces antibiotiques sont des enzymes responsables de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien, les Penicillin-Binding Proteins (PBP) dont la structure du site actif est modifiée dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques. Dans un premier temps, la résolution de la structure à haute résolution par cristallographie des rayons X de PBP1b, une des trois PBP bifonctionnelles du pneumocoque, a mis en évidence un phénomène de réorganisation structurale du site actif de la molécule en fonction de son interaction avec un pseudo-substrat de la réaction. Ce résultat nous a permis de proposer que l'ouverture du site actif joue un rôle clef lors du processus de division cellulaire. Dans un deuxième temps, nous avons résolu les structures de complexes entre PBP1b et de nouvelles molécules inhibitrices, ce qui permet d'ouvrir la voie de la mise au point rationnelle de nouveaux médicaments. Pour finir, nous avons caractérisé le domaine glycosyltransférase de PBP1b ,qui représente une nouvelle cible moléculaire pour le développement de nouveaux antibactériens, notamment par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Cette approche originale nous a permis de proposer un modèle d'organisation et de repliement de ce domaine au sein de ces protéines.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Architecture of a PKS-NRPS hybrid megaenzyme involved in the biosynthesis of the genotoxin colibactin

International audienceThe genotoxin colibactin produced by Escherichia coli is involved in the development of colorectal cancers. This secondary metabolite is synthesized by a multi-protein machinery, mainly composed of non-ribosomal peptide synthetase (NRPS)/polyketide synthase (PKS) enzymes. In order to decipher the function of a PKS-NRPS hybrid enzyme implicated in a key step of colibactin biosynthesis, we conducted an extensive structural characterization of the ClbK megaenzyme. Here we present the crystal structure of the complete trans-AT PKS module of ClbK showing structural specificities of hybrid enzymes. In addition, we report the SAXS solution structure of the full-length ClbK hybrid that reveals a dimeric organization as well as several catalytic chambers. These results provide a structural framework for the transfer of a colibactin precursor through a PKS-NRPS hybrid enzyme and can pave the way for re-engineering PKS-NRPS hybrid megaenzymes to generate diverse metabolites with many applications