Distinct triterpene synthases in the laticifers of Euphorbia lathyris

Abstract Euphorbia lathyris was proposed about fifty years ago as a potential agroenergetic crop. The tremendous amounts of triterpenes present in its latex has driven investigations for transforming this particular biological fluid into an industrial hydrocarbon source. The huge accumulation of terpenes in the latex of many plant species represent a challenging question regarding cellular homeostasis. In fact, the enzymes, the mechanisms and the controllers that tune the amount of products accumulated in specialized compartments (to fulfill ecological roles) or deposited at important sites (as essential factors) are not known. Here, we have isolated oxidosqualene cyclases highly expressed in the latex of Euphorbia lathyris. This triterpene biosynthetic machinery is made of distinct paralogous enzymes responsible for the massive accumulation of steroidal and non-steroidal tetracyclic triterpenes. More than eighty years after the isolation of butyrospermol from shea butter (Heilbronn IM, Moffet GL, and Spring FS J. Chem. Soc. 1934, 1583), a butyrospermol synthase is characterized in this work using yeast and in folia heterologous expression assays

Molecular and biotechnological approaches for cistus creticus ssp. creticus exploitation

Το φυτό Cistus creticus ssp. creticus είναι ενδημικό του Ελληνικού χώρου και αξιοποιείται εμπορικά στην Κρήτη, χάριν των αρωματικών ιδιοτήτων της ρητίνης του (“λάδανο”) η οποία παράγεται και εκκρίνεται κυρίως από τις αδενικές τρίχες που βρίσκονται στην επιφάνεια των φύλλων. Το ενδιαφέρον στο είδος αυτό εντάθηκε μετά την ανακάλυψη ότι συγκεκριμένες ουσίες της ρητίνης οι οποίες ανήκουν στην κατηγορία των λαβδανικών διτερπενίων όπως η (13Ε)-λαβδα-13-εν-8α,15-διόλη, η σκλαρεόλη και πολλά παράγωγα του οξειδίου της μανοόλης, παρουσιάζουν ισχυρή αντιμικροβιακή, κυτταροστατική και κυρίως αντιλευχαιμική δράση in vitro. Με βάση τα παραπάνω κρίθηκε ενδιαφέρουσα η μελέτη της βιοσύνθεσης των ουσιών αυτών στο συγκεκριμένο φυτό, μέσω της κλωνοποίησης και χαρακτηρισμού γονιδίων που συμμετέχουν στο βιοσυνθετικό τους μονοπάτι. Ο απώτερος στόχος ήταν από την μία η διεύρυνση των γνώσεων που έχουμε έως σήμερα πάνω στο μεταβολισμό των τερπενίων στα φυτά και από την άλλη η πιο αποδοτική εκμετάλλευση φυτών του είδους Cistus creticus ssp. creticus για τη δημιουργία νέων φαρμακευτικών και μη προϊόντων. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν γονίδια που βρίσκονται σε κομβικά σημεία στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των τερπενίων και θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του μονοπατιού. Τα γονίδια αυτά ήταν η αναγωγάση του 3-ύδροξυ-3-μέθυλο-γλουταρυλ-CoA (HMGR), η συνθετάση της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXS), η αναγωγάση της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXR) και η συνθετάση του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου (GGPPS). Απομονώθηκαν ένα πλήρες cDNA που κωδικοποιούσε την CcDXR και δύο πλήρη cDNAs που αντιστοιχούσαν στην GGPPS του λάδανου (CcGGPPS1 και CcGGPPS2). Τα CcHMGR και CcDXS cDNAs προέκυψαν από την EST ανάλυση από cDNA βιβλιοθήκη κατασκευασμένη από ολικό RNA τριχών από φύλλα του C. creticus. Η λειτουργικότητα των GGPPS cDNAs επιβεβαιώθηκε μετά από την έκφραση τους σε κύτταρα ζύμης. Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση των παραπάνω γονιδίων σε διάφορους ιστούς του φυτού και μετά από διάφορες μεταχειρίσεις. Από τις παραπάνω μελέτες προέκυψε ότι τα γονίδια αυτά παρουσιάζουν μεταξύ τους διαφορετικό πρότυπο έκφρασης και ακόμη ότι τα δύο CcGGPPS γονίδια εκφράζονται διαφορετικά κάτω από όλες σχεδόν τις συνθήκες που έχουν μελετηθεί στην παρούσα εργασία. Η έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων δεν μεταβάλλεται σημαντικά μέσα στην διάρκεια ενός έτους ή μίας ημέρας, ενώ φαίνεται να ελέγχεται αναπτυξιακά τουλάχιστον στα φύλλα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα επίπεδα των mRNAs τους ήταν σημαντικά υψηλότερα στις τρίχες που είχαν απομονωθεί από φύλλα του φυτού σε σχέση με τα ολικά φύλλα. Ακόμη παρατηρήθηκε παροδική αύξηση των mRNAs μετά από τις αβιοτικές καταπονήσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία όπως ήταν η ξηρασία, υψηλές θερμοκρασίες και μηχανικός τραυματισμός ενώ αύξηση παρατηρήθηκε και μετά από προσθήκη ιασμονικού οξέος. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη προσπάθεια μελέτης της βιοσύνθεσης των τερπενίων σε μοριακό επίπεδο στο συγκεκριμένο φυτό. Με την συνέχιση και επέκταση της έρευνας αυτής είναι πιθανό να καταστεί δυνατή η αύξηση της παραγωγής των διτερπενίων που μπορούν να παραχθούν από τους ιστούς του φυτού αυτού αλλά και η παραγωγή προϊόντων με ακόμη ισχυρότερη φαρμακολογική δράση

Sunlight-driven Environmental Benign Production of Bioactive Natural Products with Focus on Diterpenoids and the Pathways Involved in their Formation

Diterpenoids are high value compounds characterized by high structural complexity. They constitute the largest class of specialized metabolites produced by plants. Diterpenoids are flexible molecules able to engage in specific binding to drug targets like receptors and transporters. In this review we provide an account on how the complex pathways for diterpenoids may be elucidated. Following plant pathway discovery, the compounds may be produced in heterologous hosts like yeasts and E. coli. Environmentally contained production in photosynthetic cells like cyanobacteria, green algae or mosses are envisioned as the ultimate future production system

Tomato fruit chromoplasts behave as respiratory bioenergetic organelles during ripening

During tomato (Solanum lycopersicum) fruit ripening, chloroplasts differentiate into photosynthetically inactive chromoplasts. It was recently reported that tomato chromoplasts can synthesize ATP through a respiratory process called chromorespiration. Here we show that chromoplast oxygen consumption is stimulated by the electron donors NADH and NADPH and is sensitive to octyl gallate (Ogal), a plastidial terminal oxidase inhibitor. The ATP synthesis rate of isolated chromoplasts was dependent on the supply of NAD(P)H and was fully inhibited by Ogal. It was also inhibited by the proton uncoupler carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone, suggesting the involvement of a chemiosmotic gradient. In addition, ATP synthesis was sensitive to 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone, a cytochrome b 6 f complex inhibitor. The possible participation of this complex in chromorespiration was supported by the detection of one of its components (cytochrome f) in chromoplasts using immunoblot and immunocytochemical techniques. The observed increased expression of cytochrome c 6 during ripening suggests that it could act as electron acceptor of the cytochrome b 6 f complex in chromorespiration. The effects of Ogal on respiration and ATP levels were also studied in tissue samples. Oxygen uptake of mature green fruit and leaf tissues was not affected by Ogal, but was inhibited increasingly in fruit pericarp throughout ripening (up to 26% in red fruit). Similarly, Ogal caused a significant decrease in ATP content of red fruit pericarp. The number of energized mitochondria, as determined by confocal microscopy, strongly decreased in fruit tissue during ripening. Therefore, the contribution of chromoplasts to total fruit respiration appears to increase in late ripening stages.This work was supported by the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (grant no. BIO2009–09523 to A.B., including European Regional Development Funds), the Spanish Consolider-Ingenio 2010 Program (grant no. CSD2007–00036 Centre de Recerca en Agrigenòmica), and the Generalitat de Catalunya (grant no. 2009SGR0026). M.R. is recipient of a predoctoral fellowship from the Spanish Ministerio de Educación, Cultura y DeportePeer reviewe

An ATP synthase harboring an atypical γ-subunit is involved in ATP synthesis in tomato fruit chromoplasts

Chromoplasts are non-photosynthetic plastids specialized in the synthesis and accumulation of carotenoids. During fruit ripening, chloroplasts differentiate into photosynthetically inactive chromoplasts in a process characterized by the degradation of the thylakoid membranes, and by the active synthesis and accumulation of carotenoids. This transition renders chromoplasts unable to photochemically synthesize ATP, and therefore these organelles need to obtain the ATP required for anabolic processes through alternative sources. It is widely accepted that the ATP used for biosynthetic processes in non-photosynthetic plastids is imported from the cytosol or is obtained through glycolysis. In this work, however, we show that isolated tomato (Solanum lycopersicum) fruit chromoplasts are able to synthesize ATP de novo through a respiratory pathway using NADPH as an electron donor. We also report the involvement of a plastidial ATP synthase harboring an atypical γ–subunit induced during ripening, which lacks the regulatory dithiol domain present in plant and algae chloroplast γ–subunits. Silencing of this atypical γ–subunit during fruit ripening impairs the capacity of isolated chromoplast to synthesize ATP de novo. We propose that the replacement of the γ–subunit present in tomato leaf and green fruit chloroplasts by the atypical γ–subunit lacking the dithiol domain during fruit ripening reflects evolutionary changes, which allow the operation of chromoplast ATP synthase under the particular physiological conditions found in this organelle.This work was supported by grants from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (BIO2009-09523 to AB, including European Regional Development Funds), the Spanish Consolider-Ingenio 2010 Program (CSD2007-00036 Centre for Research in Agrigenomics) and the Generalitat de Catalunya (2009SGR0026). MR was the recipient of a pre-doctoral fellowship from the Spanish Ministerio de Economia y Competitividad.Peer reviewe