21 research outputs found
Identification and Structural Characterization of Interneurons of the Drosophila Brain by Monoclonal Antibodies of the Würzburg Hybridoma Library
Several novel synaptic proteins have been identified by monoclonal antibodies (mAbs) of the Würzburg hybridoma library generated against homogenized Drosophila brains, e.g. cysteine string protein, synapse-associated protein of 47 kDa, and Bruchpilot. However, at present no routine technique exists to identify the antigens of mAbs of our library that label only a small number of cells in the brain. Yet these antibodies can be used to reproducibly label and thereby identify these cells by immunohistochemical staining. Here we describe the staining patterns in the Drosophila brain for ten mAbs of the Würzburg hybridoma library. Besides revealing the neuroanatomical structure and distribution of ten different sets of cells we compare the staining patterns with those of antibodies against known antigens and GFP expression patterns driven by selected Gal4 lines employing regulatory sequences of neuronal genes. We present examples where our antibodies apparently stain the same cells in different Gal4 lines suggesting that the corresponding regulatory sequences can be exploited by the split-Gal4 technique for transgene expression exclusively in these cells. The detection of Gal4 expression in cells labeled by mAbs may also help in the identification of the antigens recognized by the antibodies which then in addition to their value for neuroanatomy will represent important tools for the characterization of the antigens. Implications and future strategies for the identification of the antigens are discussed
Identification of Eps15 as Antigen Recognized by the Monoclonal Antibodies aa2 and ab52 of the Wuerzburg Hybridoma Library against Drosophila Brain
The Wuerzburg Hybridoma Library against the
Drosophila brain represents a
collection of around 200 monoclonal antibodies
that bind to specific structures in the
Drosophila brain. Here we
describe the immunohistochemical staining
patterns, the Western blot signals of one- and
two-dimensional electrophoretic separation, and
the mass spectrometric characterization of the
target protein candidates recognized by the
monoclonal antibodies aa2 and ab52 from the
library. Analysis of a mutant of a candidate gene
identified the Drosophila homolog
of the Epidermal growth factor receptor Pathway
Substrate clone 15 (Eps15) as the antigen for
these two antibodies
Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek
For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures.Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern
Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek
For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary
structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can
be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal
antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and
characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found
to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western
blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a
single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15
(epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong
candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize
EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and
2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both
antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal
in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52
antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila
homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for
applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the
entire research community.
The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated
antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature
of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of
the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to
biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave
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promising results but could not be completed due to lack of time. Thus
biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its
identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their
staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However,
many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that
only a very limited amount of protein would be available as starting material.
Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it
impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt
their purification. However, the specific localization of these proteins makes them
highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a
highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits
they are present in. The purification and identification of such low expression
proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures.Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist
lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der
Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie
Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale
Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und
charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk
ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von
Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale
Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische
Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor
pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen
anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt,
wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D
Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster
deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen
des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit
mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt.
Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-
15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation
(IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies
Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht
zugänglich zu machen.
Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran
assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der
Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und
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da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP
nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen
Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel
nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des
Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich.
Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf
Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht.
Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur
eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese
Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine
Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen,
wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation
dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine
besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von
neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung
und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue
Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern
Adaptive molecular evolution of virulence genes of avian influenza - A virus subtype H5N1: An analysis of host radiation-0
<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Adaptive molecular evolution of virulence genes of avian influenza - A virus subtype H5N1: An analysis of host radiation"</p><p></p><p>Bioinformation 2006;1(8):321-326.</p><p>Published online 26 Dec 2006</p><p>PMCID:PMC1891714.</p><p></p