CIS-acting elements controlling the expression of the human GLI3 gene

Die Entwicklung der Gliedmaßen ist ein komplexer Vorgang, der zahlreiche molekulare Faktoren und Signalwege involviert. Diese dirigieren während der Embryogenese die Umwandlung der Gliedmaßenknospe zu den fertigen Extremitäten. Die antero-posteriore Musterbildung wird vom Signalmolekül „sonic hedgehog“ gesteuert, das über die GLI-Transkriptionsfaktoren die Transkriptionsaktivität von Zielgenen reguliert. Zeit, Lokalisierung und Menge der GLI-Transkription sind von kritischer Bedeutung. Mutationen, die das Vorhandensein der notwendigen Menge dieser Faktoren in den Zellen beeinflussen oder ihre Funktion stören, können in den Gliedmaßenknospen zu Wachstumsdefekten und andernorts zur Krebsentstehung führen. Um einen Beitrag zum Nachweis und zur funktionellen Charakterisierung von cis-regulatorischen Elementen von GLI3 und deren potentieller Bedeutung für die Pathogenität zu liefern, wurden in dieser Dissertation drei Fragen bearbeitet: · Wie wird die Expression von humanem GLI3 reguliert? · Besitzen GLI2 und GLI3 ähnliche regulatorische Elemente? · Sind Mutationen in regulatorischen Elementen von GLI3 an der Pathogenität involviert? Um letzteres vorzubereiten wurden 24 Patienten mit Gliedmaßendefekten, die als potentielle GLI3-Morphopathien klassifiziert waren, auf Punktmutationen hin untersucht. 20 Fälle, bei denen keine Mutation in der kodierenden Sequenz gefunden werden konnte, sind Kandidaten für eine Mutationssuche in cis-regulatorischen Elementen. An der Kontrolle der Transkription des GLI3-Gens sind die Promoterregion und andere cis-aktive Sequenzen, wie Enhancer, beteiligt. Ein minimaler Promotor wurde definiert und funktionell getestet. Zwei Initiationsstellen der Transkription wurden mit cDNA aus Plazenta und Skelettmuskeln identifiziert. Durch Mutagenese wurden Sequenzelemente, die an der Kontrolle der GLI3-Expression beteiligt sind, eingegrenzt. Funktionelle Studien an transgenen Mäusen hatten gezeigt, dass die Expressionsdomänen von GLI2 und GLI3 in großen Bereichen überlappen. Die transkribierte Region von GLI2 wurde im 5’-Bereich gegenüber der bekannten cDNA um 1 kb nicht kodierender DNA ausgedehnt. Trotzdem konnten Sequenzvergleiche zwischen Mensch und Maus keine Homologie zwischen regulatorischen Elementen von GLI2 oder GLI3 entdecken. Die genomische Sequenz von GLI3 wurde für evolutionäre Vergleiche benutzt, um nach hochkonservierten, nicht-kodierenden Elementen zu suchen, die eventuell cis-regulatorische Elemente repräsentieren. Drei so entdeckte potentielle Enhancerelemente wurden in transient transfizierten Zellen daraufhin untersucht, ob sie die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle des minimalen GLI3-Promoters steuern konnten. Durch Mutagenese vorhergesagter Bindungssequenzen für Transkriptionsfaktoren und nachfolgende Analyse der regulatorischen Kapazität der Elemente in zellulären Reportergentests wurden funktionell besonders bedeutsame Stellen definiert. An diese Bereiche bindende Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von GLI3 involviert sein könnten, wie NFATp, müssen noch bestätigt werden. Die drei Elemente wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin untersucht, in transgenen Mäusen ein Reportergen zu aktivieren. In transgenen Mausembryonen konnte beobachtet werden, dass eines der potentiellen Enhancerelemente ein Expressionsmuster steuerte, das zeitlich und räumlich einem Teil des endogenen Maus-GLI3-Musters entsprach, vor allem im Gehirn, den Mandibeln, im Nasenbereich und im Herzen. Die erzielten Ergebnisse tragen zum Verständnis der räumlichen und zeitlichen Expressionskontrolle von GLI3 bei, dem Schlüsselfaktor der „sonic hedgehog“- Signalkaskade, und verschaffen einen Einblick in die potentielle Rolle hochkonservierter, nicht-kodierender Sequenzelemente im menschlichen Genom

Machine Learning Meets the Semantic Web

Remarkable progress in research has shown the efficiency of Knowledge Graphs (KGs) in extracting valuable external knowledge in various domains. A Knowledge Graph (KG) can illustrate high-order relations that connect two objects with one or multiple related attributes. The emerging Graph Neural Networks (GNN) can extract both object characteristics and relations from KGs. This paper presents how Machine Learning (ML) meets the Semantic Web and how KGs are related to Neural Networks and Deep Learning. The paper also highlights important aspects of this area of research, discussing open issues such as the bias hidden in KGs at different levels of graph representation

CIS-acting elements controlling the expression of the human GLI3 gene

Die Entwicklung der Gliedmaßen ist ein komplexer Vorgang, der zahlreiche molekulare Faktoren und Signalwege involviert. Diese dirigieren während der Embryogenese die Umwandlung der Gliedmaßenknospe zu den fertigen Extremitäten. Die antero-posteriore Musterbildung wird vom Signalmolekül „sonic hedgehog“ gesteuert, das über die GLI-Transkriptionsfaktoren die Transkriptionsaktivität von Zielgenen reguliert. Zeit, Lokalisierung und Menge der GLI-Transkription sind von kritischer Bedeutung. Mutationen, die das Vorhandensein der notwendigen Menge dieser Faktoren in den Zellen beeinflussen oder ihre Funktion stören, können in den Gliedmaßenknospen zu Wachstumsdefekten und andernorts zur Krebsentstehung führen. Um einen Beitrag zum Nachweis und zur funktionellen Charakterisierung von cis-regulatorischen Elementen von GLI3 und deren potentieller Bedeutung für die Pathogenität zu liefern, wurden in dieser Dissertation drei Fragen bearbeitet: · Wie wird die Expression von humanem GLI3 reguliert? · Besitzen GLI2 und GLI3 ähnliche regulatorische Elemente? · Sind Mutationen in regulatorischen Elementen von GLI3 an der Pathogenität involviert? Um letzteres vorzubereiten wurden 24 Patienten mit Gliedmaßendefekten, die als potentielle GLI3-Morphopathien klassifiziert waren, auf Punktmutationen hin untersucht. 20 Fälle, bei denen keine Mutation in der kodierenden Sequenz gefunden werden konnte, sind Kandidaten für eine Mutationssuche in cis-regulatorischen Elementen. An der Kontrolle der Transkription des GLI3-Gens sind die Promoterregion und andere cis-aktive Sequenzen, wie Enhancer, beteiligt. Ein minimaler Promotor wurde definiert und funktionell getestet. Zwei Initiationsstellen der Transkription wurden mit cDNA aus Plazenta und Skelettmuskeln identifiziert. Durch Mutagenese wurden Sequenzelemente, die an der Kontrolle der GLI3-Expression beteiligt sind, eingegrenzt. Funktionelle Studien an transgenen Mäusen hatten gezeigt, dass die Expressionsdomänen von GLI2 und GLI3 in großen Bereichen überlappen. Die transkribierte Region von GLI2 wurde im 5’-Bereich gegenüber der bekannten cDNA um 1 kb nicht kodierender DNA ausgedehnt. Trotzdem konnten Sequenzvergleiche zwischen Mensch und Maus keine Homologie zwischen regulatorischen Elementen von GLI2 oder GLI3 entdecken. Die genomische Sequenz von GLI3 wurde für evolutionäre Vergleiche benutzt, um nach hochkonservierten, nicht-kodierenden Elementen zu suchen, die eventuell cis-regulatorische Elemente repräsentieren. Drei so entdeckte potentielle Enhancerelemente wurden in transient transfizierten Zellen daraufhin untersucht, ob sie die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle des minimalen GLI3-Promoters steuern konnten. Durch Mutagenese vorhergesagter Bindungssequenzen für Transkriptionsfaktoren und nachfolgende Analyse der regulatorischen Kapazität der Elemente in zellulären Reportergentests wurden funktionell besonders bedeutsame Stellen definiert. An diese Bereiche bindende Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von GLI3 involviert sein könnten, wie NFATp, müssen noch bestätigt werden. Die drei Elemente wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin untersucht, in transgenen Mäusen ein Reportergen zu aktivieren. In transgenen Mausembryonen konnte beobachtet werden, dass eines der potentiellen Enhancerelemente ein Expressionsmuster steuerte, das zeitlich und räumlich einem Teil des endogenen Maus-GLI3-Musters entsprach, vor allem im Gehirn, den Mandibeln, im Nasenbereich und im Herzen. Die erzielten Ergebnisse tragen zum Verständnis der räumlichen und zeitlichen Expressionskontrolle von GLI3 bei, dem Schlüsselfaktor der „sonic hedgehog“- Signalkaskade, und verschaffen einen Einblick in die potentielle Rolle hochkonservierter, nicht-kodierender Sequenzelemente im menschlichen Genom

Toward supramolecular architectures of the anti-HIV drug lamivudine: understanding the effect of the inclusion of water in a hydrochloride form

Two salts of the anti-HIV drug lamivudine, namely, lamivudine hydrochloride and lamivudine hydrochloride monohydrate, were prepared for the first time. Structural relationships and the role of water in crystal assembly and lamivudine conformation were established and allowed for a rational approach to understand how solid state properties could be changed by engineering new salts of the drug.Brazilian Research Council CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico)Brazilian Research Council CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico) [472623/2011-7]Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC) of SpainConsejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC) of Spai

Human intronic enhancers control distinct sub-domains of Gli3 expression during mouse CNS and limb development

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The zinc-finger transcription factor GLI3 is an important mediator of Sonic hedgehog signaling and crucial for patterning of many aspects of the vertebrate body plan. In vertebrates, the mechanism of SHH signal transduction and its action on target genes by means of activating or repressing forms of GLI3 have been studied most extensively during limb development and the specification of the central nervous system. From these studies it has emerged, that <it>Gli3 </it>expression must be subject to a tight spatiotemporal regulation. However, the genetic mechanisms and the cis-acting elements controlling the expression of <it>Gli3 </it>remained largely unknown.</p> <p>Results</p> <p>Here, we demonstrate in chicken and mouse transgenic embryos that human <it>GLI3</it>-intronic conserved non-coding sequence elements (CNEs) autonomously control individual aspects of <it>Gli3 </it>expression. Their combined action shows many aspects of a <it>Gli3</it>-specific pattern of transcriptional activity. In the mouse limb bud, different CNEs enhance <it>Gli3</it>-specific expression in evolutionary ancient stylopod and zeugopod versus modern skeletal structures of the autopod. Limb bud specificity is also found in chicken but had not been detected in zebrafish embryos. Three of these elements govern central nervous system specific gene expression during mouse embryogenesis, each targeting a subset of endogenous <it>Gli3 </it>transcription sites. Even though fish, birds, and mammals share an ancient repertoire of gene regulatory elements within <it>Gli3</it>, the functions of individual enhancers from this catalog have diverged significantly. During evolution, ancient broad-range regulatory elements within <it>Gli3 </it>attained higher specificity, critical for patterning of more specialized structures, by abolishing the potential for redundant expression control.</p> <p>Conclusion</p> <p>These results not only demonstrate the high level of complexity in the genetic mechanisms controlling <it>Gli3 </it>expression, but also reveal the evolutionary significance of <it>cis</it>-acting regulatory networks of early developmental regulators in vertebrates.</p

An ultraconserved Hox–Pbx responsive element resides in the coding sequence of Hoxa2 and is active in rhombomere 4

The Hoxa2 gene has a fundamental role in vertebrate craniofacial and hindbrain patterning. Segmental control of Hoxa2 expression is crucial to its function and several studies have highlighted transcriptional regulatory elements governing its activity in distinct rhombomeres. Here, we identify a putative Hox–Pbx responsive cis-regulatory sequence, which resides in the coding sequence of Hoxa2 and is an important component of Hoxa2 regulation in rhombomere (r) 4. By using cell transfection and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays, we show that this regulatory sequence is responsive to paralogue group 1 and 2 Hox proteins and to their Pbx co-factors. Importantly, we also show that the Hox–Pbx element cooperates with a previously reported Hoxa2 r4 intronic enhancer and that its integrity is required to drive specific reporter gene expression in r4 upon electroporation in the chick embryo hindbrain. Thus, both intronic as well as exonic regulatory sequences are involved in Hoxa2 segmental regulation in the developing r4. Finally, we found that the Hox–Pbx exonic element is embedded in a larger 205-bp long ultraconserved genomic element (UCE) shared by all vertebrate genomes. In this respect, our data further support the idea that extreme conservation of UCE sequences may be the result of multiple superposed functional and evolutionary constraints

Early Evolution of Conserved Regulatory Sequences Associated with Development in Vertebrates

Comparisons between diverse vertebrate genomes have uncovered thousands of highly conserved non-coding sequences, an increasing number of which have been shown to function as enhancers during early development. Despite their extreme conservation over 500 million years from humans to cartilaginous fish, these elements appear to be largely absent in invertebrates, and, to date, there has been little understanding of their mode of action or the evolutionary processes that have modelled them. We have now exploited emerging genomic sequence data for the sea lamprey, Petromyzon marinus, to explore the depth of conservation of this type of element in the earliest diverging extant vertebrate lineage, the jawless fish (agnathans). We searched for conserved non-coding elements (CNEs) at 13 human gene loci and identified lamprey elements associated with all but two of these gene regions. Although markedly shorter and less well conserved than within jawed vertebrates, identified lamprey CNEs are able to drive specific patterns of expression in zebrafish embryos, which are almost identical to those driven by the equivalent human elements. These CNEs are therefore a unique and defining characteristic of all vertebrates. Furthermore, alignment of lamprey and other vertebrate CNEs should permit the identification of persistent sequence signatures that are responsible for common patterns of expression and contribute to the elucidation of the regulatory language in CNEs. Identifying the core regulatory code for development, common to all vertebrates, provides a foundation upon which regulatory networks can be constructed and might also illuminate how large conserved regulatory sequence blocks evolve and become fixed in genomic DNA

Human GLI3 Intragenic Conserved Non-Coding Sequences Are Tissue-Specific Enhancers

The zinc-finger transcription factor GLI3 is a key regulator of development, acting as a primary transducer of Sonic hedgehog (SHH) signaling in a combinatorial context dependent fashion controlling multiple patterning steps in different tissues/organs. A tight temporal and spatial control of gene expression is indispensable, however, cis-acting sequence elements regulating GLI3 expression have not yet been reported. We show that 11 ancient genomic DNA signatures, conserved from the pufferfish Takifugu (Fugu) rubripes to man, are distributed throughout the introns of human GLI3. They map within larger conserved non-coding elements (CNEs) that are found in the tetrapod lineage. Full length CNEs transiently transfected into human cell cultures acted as cell type specific enhancers of gene transcription. The regulatory potential of these elements is conserved and was exploited to direct tissue specific expression of a reporter gene in zebrafish embryos. Assays of deletion constructs revealed that the human-Fugu conserved sequences within the GLI3 intronic CNEs were essential but not sufficient for full-scale transcriptional activation. The enhancer activity of the CNEs is determined by a combinatorial effect of a core sequence conserved between human and teleosts (Fugu) and flanking tetrapod-specific sequences, suggesting that successive clustering of sequences with regulatory potential around an ancient, highly conserved nucleus might be a possible mechanism for the evolution of cis-acting regulatory elements