New protein and peptide based food ingredients applied to meat color and calcium bioavailability

Este trabalho está dividido em dois capítulos. O primeiro teve como objetivo avaliar a possível obtenção de pigmentos proteináceos com potencial para serem empregados em produtos cárneos e carnes baseadas em proteínas de plantas. A indústria de carnes possui grande interesse no desenvolvimento de alternativas consideradas mais saudáveis para o processo de cura. Neste sentido a zinco-protoporfirina IX (ZnPP), pigmento responsável pela coloração do presunto Parma, se mostra uma alternativa interessante, uma vez que, este presunto desenvolve uma coloração vermelha brilhante altamente estável, mesmo sem a adição de nitritos. Sendo assim, foi avaliada a possível obtenção de pigmentos proteináceos, análogos a ZnPP, a partir da hemoglobina do sangue bovino e leghemoglobina recombinante de cana-de-açúcar (ScLegHb). A obtenção do pigmento frente a hemoglobina comercial de sangue bovino se mostrou demasiadamente complexa, sendo assim, do ponto de vista da aplicabilidade industrial a obtenção do pigmento utilizando o sangue bovino como precursor não se mostrou uma alternativa viável. Ainda assim, foram determinados parâmetros que podem auxiliar em futuros estudos envolvendo a Hb, como a constante de dissociação tetrâmero-dímero e as constantes de auto-oxidação de primeira ordem na presença de íons zinco. A obtenção do pigmento tendo como fonte a ScLegHb é uma via promissora, no entanto, considerando-se a aplicabilidade pretendida, e a infraestrutura disponível, a mesma não se mostrou uma alternativa viável, uma vez que o rendimento obtido foi muito baixo. Entretanto, foi realizada a caracterização biofísica da proteína, que mostrou que a ScLegHb produzida apresenta estrutura secundária (sendo constituída principalmente por α-hélices) e terciária e se comporta como um monômero alongado em solução. O segundo capítulo teve como objetivo explorar possíveis efeitos de dois hidrolisados comerciais de proteínas do leite na complexação de íons Ca2+ e na supersaturação da solução de CaHPO4/Na2HCitrato. Entender o processo de como o cálcio se complexa com compostos do leite, com compostos adicionados ao leite e com compostos formados durante o processamento de alimentos derivados de leite, bem como investigar a supersaturação de sais de cálcio para o aumento da biodisponibilidade deste mineral é de extrema relevância para a criação de estratégias que visam aumentar a biodisponibilidade do cálcio e, consequentemente prevenir as doenças originadas pela deficiência em sua absorção, como a osteoporose. Foram avaliados dois produtos comerciais fornecidos pela Arla Foods Ingredients, um hidrolisado de caseínas (Lacprodan) e outro hidrolisado de whey protein (Peptigen). Os hidrolisados foram brevemente caracterizados, determinando-se a concentração total de cálcio e o perfil peptídico destes. Também foram determinadas as constantes de associação entre os hidrolisados e os íons Ca2+ em diferentes temperaturas, que mostraram uma reação exotérmica para a ligação dos íons Ca2+. Por fim, os hidrolisados mostraram um efeito significativo no aumento da concentração de íons Ca2+ livre em solução para a solução supersaturada CaHPO4/Na2HCitrato. É proposto que este aumento na concentração de Ca2+ livre em solução está associado a uma hidrólise contínua dos hidrolisados causada por enzimas termorresistentes inerentes à fração do leite ou às enzimas adicionadas durante a fabricação dos hidrolisados.This work is divided into two chapters. The first aimed to evaluate the possible obtaining of proteinaceous pigments with potential to be used in the curing process of meat products. The meat industry has great interest in the development of healthier alternatives for the meat curing process. Considering this, zinc-protoporphyrin IX (ZnPP), the pigment responsible for the coloring of Parma ham, is an interesting alternative, since the Parma ham develops a highly stable bright red color, without the addition of nitrites. Therefore, the possible obtainment of proteinaceous pigments, analogous to ZnPP, from bovine blood hemoglobin and recombinant leg-hemoglobin (ScLegHb) from sugarcane was evaluated. Obtaining the pigment against commercial bovine blood hemoglobin proved to be too complex, and considering the industrial applicability, obtaining the pigment using bovine blood as a precursor did not prove to be a practicable alternative, however, even so, parameters, that can help in future studies involving Hb, such as the tetramer- dimer dissociation constant and the first order auto-oxidation constant in the presence of zinc ions, were determined. Obtaining the pigment from leguminous recombinant leghemoglobin is a very promising route, however, considering the intended applicability, and the infrastructure available for the production and purification of ScLegHb, it did not prove to be a viable alternative, since the yield obtained was very low. Even so, the biophysical characterization of ScLegHb was performed, which showed that the produced protein has a secondary (consisting mainly of α-helices) and tertiary structure and behaves as an elongated monomer in solution. The second chapter aimed to explore possible effects of two commercial hydrolysates of milk proteins on the complexation of Ca2+ ions and on the supersaturation of the CaHPO4/Na2HCitrate solution. Understanding the process of how calcium complexes with milk compounds, with compounds added to milk and with compounds formed during the processing of dairy foods, as well as investigating the supersaturation of calcium salts to increase the bioavailability of this mineral is extremely important relevance for the creation of strategies to increase the bioavailability of calcium and, consequently, prevent diseases caused by the deficiency in its absorption, such as osteoporosis. Two commercial products supplied by Arla Foods Ingredients were evaluated, a casein hydrolyzate (Lacprodan) and a whey protein hydrolyzate (Peptigen). The hydrolysates were briefly characterized, determining their total calcium concentration and their peptide profile. The association constants between the hydrolysates and the Ca2+ ions were determined at different temperatures, which showed an exothermic reaction for Ca2+ ions binding. Finally, the hydrolysates showed a significant effect in increasing the concentration of free Ca2+ ions in solution for the supersaturated CaHPO4/Na2HCitrate solution. It is proposed that this increase in the concentration of free Ca2+ in solution is associated with a continuous hydrolysis of the hydrolysates caused by heat resistant enzymes inherent to the milk fraction or the enzymes added during the manufacture of the hydrolysates

Expression, Purification and Studies of Ferrochelatase from Bacillus subtilis

A cor vermelha brilhante característica do presunto Parma é resultante, principalmente, do pigmento Zinco-protoporfirina IX (ZnPP). A ZnPP é formada a partir da mioglobina por uma reação de transmetalação, catalisada pela enzima ferroquelatase (FECH), em que o íon de Fe(II) coordenado ao grupo heme é substituído pelo íon Zn(II). O presunto Parma apresenta uma maior estabilidade oxidativa em relação aos demais produtos cárneos curados além de não conter nitrito e nitrato, portanto, são considerados mais saudáveis. A utilização da FECH no processamento de carnes curadas pode permitir a produção de produtos cárneos curados mais saudáveis e em menor tempo. No presente trabalho a proteína ferroquelatase de Bacillus subtilis (BsFECH) foi expressa em células de E. coli BL21(DE3), purificada por cromatografia de afinidade ao níquel e exclusão por tamanho e caracterizada por dicroísmo circular, emissão de fluorescência do triptofano e cromatografia de exclusão por tamanho analítico. Em termos de estabilidade foi encontrado que altas concentrações de sal aumentam a estabilidade da proteína frente aos agentes denaturantes ureia e temperatura. A BsFECH produzida é capaz de ligar-se ao substrato modelo de porfirina (TPPS), conforme verificado por espectroscopia de UV-Vis, com uma Ka = 3,8x105 M-1 e é capaz de se associar à metamioglobina, conforme verificado por reação de cross-linking com dissuccinimidil suberato e avaliado por SDS-PAGE. A BsFECH aumenta significativamente a taxa de inserção de íons de zinco na TPPS e mostra uma cinética de saturação com uma constante de ligação aparente de Zn(II) ao complexo [BsFECH-TPPS] de 1,3x104 M e uma constante de primeira ordem de 6,6x10-1 h-1 para a dissociação do complexo ternário. A reação de troca ferro/zinco na mioglobina catalisada pela BsFECH é facilitada pela proteólise limitada da mioglobina com pepsina que abre um caminho para a reação de troca metálica com base na interação proteína-proteína entre o fragmento globina da mioglobina e a BsFECH.The bright red color, characteristic of the Parma ham, results mainly of the pigment Zinc-Protoporphyrin IX (ZnPP). The ZnPP is formed from myoglobin by the reaction, catalyzed by ferrochelatase enzyme (FECH), in which Fe(II) ions coordinated to the heme group is replaced by Zn(II) ions. Parma ham shows greater oxidative stability when compared to others cured meat products besides do not contain nitrite and nitrate and, therefore, is considered healthier. The use of FECH in the processing of cured meats may allow the production of healthier cured meat products in a shorter period of time. In this work, the ferrochelatase protein from Bacillus subtilis was expressed in E. coli BL21(DE3) cells, purified by nickel affinity chromatography and size exclusion, and characterized by circular dichroism, fluorescence emission of tryptophan and analytical size exclusion chromatography. In terms of stability, it was found that the high salt content enhances the protein stability against the denaturation agents urea and temperature. The BsFECH produced is able to bind to the porphyrin model substrate (TPPS), as verified by UV-Vis spectroscopy, with Ka = 3.8x105 M-1 and is capable to associate to metamyoglobin as verified by cross-linking reaction with dissuccinimidil suberato, as observed by SDS-PAGE. The BsFECH increases, significantly, the zinc ions insertion rate in TPPS and shows a saturation kinetics behavior with an apparent biding constant of Zn(II) to the [BsFECH-TPPS] complex of 1.3x104 M and a first order rate constant for the dissociation of ternary complex of 6.6x10-1 h-1. The Fe/Zn exchange reaction in the myoglobin as catalyzed by BsFECH is facilitated by myoglobin-limited proteolysis with pepsin that opens a reaction channel for the metallic exchange based on protein-protein interaction between the globin moiety of myoglobin and BsFECH