In print como método não invasivo de coleta de amostra para o diagnóstico molecular da leishmaniose cutânea em população militar da Colômbia

Taking into account that the traditional methods of sampling and diagnosis for cutaneous leishmaniasis , have limitations, such as direct smear, whose sensitivity depends on the professional's expertise, the lesion aspiration that can be used to detect parasites in the lamina, dna or cultures takes a long time and is demanding, and the biopsy of the lesion that is invasive and painful were compared with the imprinting method on the filter paper of the ulcerative lesion against the traditional method of aspiration by means of the conventional pcr technique using as a target a dna region of the parasite kinetoplast. In this present work, pcr obtained an imprinting sensitivity of 90.07% compared to the aspirate of 86.3%, which, besides being a non-invasive sampling method, with few transport requirements, it can be taken directly in the area of operations at a very low cost, which turns out to be beneficial to be used in patients with cutaneous leishmaniasis of the National Army of Colombia, who are in different operations areas.Teniendo en cuenta que los métodos tradicionales de toma de muestra y diagnóstico para la leishmaniosis cutánea presentan limitaciones, como el frotis directo, cuya sensibilidad depende de la pericia del profesional, el aspirado de lesión que puede ser usado para detección de parásitos en lámina, su adn o para cultivos es demorado y exigente, y la biopsia de la lesión que es invasiva y dolorosa se comparó con el método de impronta en papel filtro de la lesión ulcerativa contra el método tradicional de aspirado mediante la técnica de pcr convencional utilizando como blanco una región del adn del kinetoplasto del parásito. En el presente trabajo, la pcr obtuvo una sensibilidad para impronta del 90,07% comparado con el aspirado, el 86,3%, que, además, por ser un método de toma de muestra no invasivo, con pocas exigencias para el transporte, se puede tomar directamente en el área de operaciones a muy bajo costo, resulta ser beneficioso para ser usado en los pacientes con leishmaniosis cutánea del Ejército Nacional de Colombia, que se encuentran en las diferentes áreas de operaciones.Considerando que os métodos tradicionais de coleta de amostra e diagnóstico para a leishmaniose cutânea apresentam limitações, como exame direto de esfregaços, cuja sensibilidade depende da perícia do profissional, o raspado de lesão que pode ser usado para a detecção de parasitas em lâmina, seu dna ou para culturas é demorado e exigente, e a biopsia da lesão que é invasiva e dolorosa, comparou-se com o método in print em papel filtro da lesão ulcerativa contra o método tradicional de aspirado mediante a técnica de pcr convencional utilizando como alvo uma região do dna do cinetoplasto do parasita. No presente trabalho, a pcr obteve uma sensibilidade para in print de 90,07% comparado com o aspirado, 86,3%, que, além disso, por ser um método de coleta de amostra não invasivo, com poucas exigências para o transporte, pode ser coletado diretamente na área de operações a muito baixo custo, resulta ser benéfico para ser usado nos pacientes com leishmaniose cutânea do Exército Nacional da Colômbia, que se encontram nas diferentes áreas de operações

Parasitic load, spatial distribution, and genetic diversity of Leishmania spp in military personnel of the Colombian National Army with cutaneous Leishmaniasis

Antecedentes: Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades de transmisión vectorial causada por parásitos protozoarios del género Leishmania transmitido por insectos flebótomos hembras. Dentro de las manifestaciones clínicas de la enfermedad está la leishmaniasis cutánea (LC), mucocutánea (LMC) y visceral (LV). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las leishmaniasis están presentes en 98 países, con una incidencia de 1,3 millones de casos anuales. En Colombia, el 98% de los casos reportados corresponden a LC y de estos, alrededor del 50% corresponden a pacientes de las Fuerzas Militares debido a sus operaciones en áreas endémicas. Actualmente, en el Ejército Nacional de Colombia se lleva un estricto seguimiento clínico al tratamiento con antimoniato de meglumina, sin evidencia científica de la resolución de la enfermedad por métodos moleculares, lo que conlleva a eventos adversos por fallas terapéuticas o recidivas, generando altos costos en la logística Militar. Objetivos: Los objetivos del estudio fueron cuantificar la carga parasitaria, evaluar la efectividad del tratamiento (1er esquema antimoniato de meglumina y 2do esquema isetionato de pentamidina) mediante métodos moleculares y determinar la distribución, y diversidad genética de Leishmania spp en personal militar del Ejército Nacional de Colombia con leishmaniasis cutánea entre el 2017 – 2019. Metodología: Se recolectaron muestras de frotis / biopsia y sangre periférica en 136 pacientes con LC. El ADNk del minicírculo se amplificó mediante qPCR. Se realizaron pruebas no paramétricas y análisis de componentes principales (ACP) con datos clínico-epidemiológicos y moleculares. Las especies de Leishmania se identificaron mediante BLASTn de acuerdo con las secuencias de HSP70 y MPI. La distribución geoespacial de los parásitos identificados se determinó según el posible sitio de infección. Se construyeron árboles genéticos por verosimilitud máxima (VM), se estimaron índices de diversidad (π, h) y se construyó una red de haplotipos bajo el algoritmo Templeton-Crandall-Sing para determinar las relaciones geográficas de las variantes genéticas de las especies de Leishmania que circulan en la población militar colombiana. Resultados: El 83,09% de los pacientes al finalizar el tratamiento presentaron cargas parasitarias en L. braziliensis que en L. panamensis, mientras h > L. braziliensis frente a L. panamensis. Conclusiones: En conclusión, a través del seguimiento se demostró la eficacia de la cuantificación de la carga parasitaria para evaluar el pronóstico de la LC, así como de los tratamientos farmacéuticos mostrando una disminución significativa de la carga parasitaria. La distribución sugirió que L. braziliensis tiene una mayor abundancia, mientras que L. panamensis tiene una mayor dispersión. Las relaciones filogenéticas de especies de Leishmania en personal militar colombiano se estimaron con la confirmación de dos nuevas especies circulando sin reporte previo en el país y una especie sin antecedentes de LC en el Ejército Colombiano. Finalmente, L. braziliensis presentó una diversidad genética sustancial. Palabras claves: Leishmania spp., leishmaniasis cutánea, carga parasitaria, antimoniato de meglumina, isetionato de pentamidina, ADNk, HSP70, MPI, filogenética, diversidad genética, Ejército Nacional de Colombia.Grupo de investigación en Enfermedades Tropicales del Ejército Nacional- GINETEJMagíster en Ciencias Básicas BiomédicasMaestríaBackground: Leishmaniasis is a vector-borne disease caused by a protozoan parasite of the genus Leishmania transmitted by female sandfly insects. Among the clinical manifestations of the disease are cutaneous (CL), mucocutaneous (MCL) and visceral (VL) leishmaniasis. According to the World Health Organization (WHO), leishmaniasis is present in 98 countries, with an incidence of 1.3 million new cases annually. In Colombia, 98% of the reported cases correspond to CL and of these, around 50% correspond to patients of the Military Forces due to their operations in endemic areas. Currently, the Colombian National Army carries out strict clinical monitoring of the treatment with meglumine antimoniate, without scientific evidence of the disease resolution by molecular methods, which leads to adverse events due to therapeutic failures or recurrences, generating high costs in Military logistics. Aims: The objectives of the study were to quantify the parasite load, evaluate the effectiveness of the treatment (1st line of meglumine antimoniate and 2nd line of pentamidine isethionate) by molecular methods and determine the distribution as well as the genetic diversity of Leishmania spp in military personnel of the Colombian National Army with cutaneous leishmaniasis between 2017 – 2019. Methods: Smear / biopsy and peripheral blood samples were collected from 136 patients with CL. The minicircle kDNA was amplified by qPCR. Non-parametric tests and principal component analysis (PCA) were performed with clinic-epidemiological and molecular data. Leishmania species were identified by BLASTn according to HSP70 and MPI sequences. The geo-spatial distribution of the identified parasites was determined according to the possible site of infection. Gene trees were constructed by maximum likelihood (ML) and diversity indices (π, h) were estimated and haplotype network was constructed under the Templeton-Crandall-Sing algorithm in order to determine the geographic relationships of the genetic variants of Leishmania species circulating in Colombian military population. Results: 83.09% of the patients at the end of the treatment presented parasite loads in L. braziliensis than in L. panamensis, while h > L. braziliensis against L. panamensis. Conclusions: In conclusion, through follow-up, the efficacy of the parasite quantification was demonstrated to evaluate the prognosis of CL, as well as the pharmaceutical treatments showing a significant decrease in the parasite load. The distribution suggested that L. braziliensis has a greater abundance, while L. panamensis has a greater dispersion. The phylogenetic relationships of Leishmania species in Colombian military personnel was estimated with the confirmation of two new species circulating without prior report in the country and a species with no background for CL in the Colombian army. Finally, L. braziliensis had a substantial genetic diversity. Keywords: Leishmania spp., cutaneous leishmaniasis, parasitic load, meglumine antimoniate, pentamidine isethionate, kDNA, HSP70, MPI, phylogenetics, genetic diversity, The Colombian National Army