Identification of Two Eosinophil Subsets in Induced Sputum from Patients with Allergic Asthma According to CD15 and CD66b Expression

Allergic asthma; Eosinophil subsets; Induced sputumAsma alérgica; Subconjuntos de eosinófilos; Esputo inducidoAsma al·lèrgica; Subconjunts d'eosinòfils; Esput induïtTwo subsets of eosinophils have been described: resident eosinophils with homeostatic functions (rEOS) in healthy subjects and in patients with nonallergic eosinophilic asthma, and inflammatory eosinophils (iEOS) in blood and lung samples from patients with allergic asthma. We explored if it would be possible to identify different subsets of eosinophils using flow cytometry and the gating strategy applied to induced sputum. We conducted an observational cross-sectional single-center study of 62 patients with persistent allergic asthma. Inflammatory cells from induced sputum samples were counted by light microscopy and flow cytometry, and cytokine levels in the supernatant were determined. Two subsets of eosinophils were defined that we call E1 (CD66b-high and CD15-high) and E2 (CD66b-low and CD15-low). Of the 62 patients, 24 were eosinophilic, 18 mixed, 10 paucigranulocytic, and 10 neutrophilic. E1 predominated over E2 in the eosinophilic and mixed patients (20.86% vs. 6.27% and 14.42% vs. 4.31%, respectively), while E1 and E2 were similar for neutrophilic and paucigranulocytic patients. E1 correlated with IL-5, fractional exhaled nitric oxide, and blood eosinophils. While eosinophil subsets have been identified for asthma in blood, we have shown that they can also be identified in induced sputum.This research was supported by the Spanish Allergy and Clinical Immunology Society (SEAIC) by means of a grant awarded in the call of 2017 (reference 17/06) and a BRN—Fundació Pla i Armengol grant in the call of 2018. The funds provided contributed to the acquisition of the material necessary to carry out the study, but the collaborating entities had no role in the analysis or interpretation of the results

Local terrestrial snails as natural intermediate hosts of the zoonotic parasite Angiostrongylus cantonensis in the new European endemic area of Valencia, Spain

Aim: The rat lungworm, Angiostrongylus cantonensis, has recently been found in the city of Valencia, parasitizing rats, Rattus norvegicus and Rattus rattus, its natural definitive hosts. This is the first finding of this zoonotic nematode in continental Europe. After informing local and national health authorities, the collection of local terrestrial snails took place with the aim of elucidating their potential role as intermediate hosts of A. cantonensis. Methods and Results: A total of 145 terrestrial snails, belonging to the species Cernuella virgata, Cornu aspersum, Eobania vermiculata, Otala punctata, Pseudotachea splendida, Rumina decollata and Theba pisana, were randomly collected between May and December 2022 in public gardens, parks and orchards in six districts of Valencia, in five of which A. cantonensis had been reported previously in rats. Once collected and identified, the snails were frozen at −20°C. Subsequently, the DNA was isolated and screened by PCR using specific primers targeting the A. cantonensis COI gene. Seven individual snails, belonging to the species C. virgata, C. aspersum and T. pisana, were positive, for an overall prevalence of 4.8%. The PCR product from one of them was sequenced by Sanger sequencing. Conclusions: The three positive terrestrial snail species are among the edible species that are frequently included in various dishes in Spain. C. virgata is reported as a previously unrecorded intermediate host and should be added to the list of more than 200 species of terrestrial snails that have been reported worldwide as intermediate hosts of the rat lungworm. Considering that these terrestrial snails may release infective larvae of A. cantonensis on leafy green vegetables on which they feed and during their handling and preparation for consumption, prophylactic measures to prevent human neuroangiostrongyliasis in Valencia and other regions to which this zoonotic parasite may spread are recommended

Parasite Fauna and Coinfections in Urban Rats Naturally Infected by the Zoonotic Parasite Angiostrongylus cantonensis

When the zoonotic parasite of rodents that can cause human neuroangiostrongyliasis, i.e., Angiostrongylus cantonensis, is found in its natural definitive hosts, it is usually reported in isolation, as if the rat lungworm were the only component of its parasite community. In this study, we report the coinfections found in rats naturally infected by A. cantonensis in urban populations of Rattus norvegicus and Rattus rattus in Valencia, Spain. In addition to the rat lungworms, which were found in 14 of the 125 rats studied (a prevalence of 11.20%), 18 other parasite species (intestinal and tissular protists, microsporidia and helminths) were found, some of them with high burdens. Fourteen of these nineteen species found are potential zoonotic parasites, namely Blastocystis, Giardia duodenalis, Cryptosporidium spp., Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon hellem, Toxoplasma gondii, Brachylaima spp., Hydatigera taeniaeformis s.l. larvae, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, Angiostrongylus cantonensis, Calodium hepaticum, Gongylonema neoplasticum andMoniliformis moniliformis. The total predominance of coinfected rats as well as their high parasite loads seem to indicate a trend towards parasite tolerance

Un nuevo conjunto de monedas emirales del centro peninsular: Los dírhams del yacimiento arqueológico de El Rebollar (El Boalo, Madrid)

A small set of five dirhams from the Emirate period is presented, located inside the late rural church of El Rebollar (El Boalo, Madrid). This ecclesiastical building can be dated from the grave goods of the tombs and from the C14 analysis applied to the bone samples from the individuals buried between the second half of the viith century and the beginning of the viiith century. The coins have a closing date that refers to the period of government of al-Hakam I (180-206 h./ad 796-822). The study of this numismatic set in its context, the reading without difficulty of the legends which allow us to deduce variations in the coins and the analysis of their composition, which we present in this study, provide data which contribute to a better understanding of the production and circulation of emerald money in the central area of the Iberian Peninsula.Se da a conocer un pequeño conjunto de cinco dírhams de época emiral localizado en el interior de la iglesia rural tardoantigua de El Rebollar (El Boalo, Madrid). Este edificio eclesiástico se ha podido fechar a partir de los ajuares funerarios de las tumbas y del análisis de C14 realizado sobre las muestras óseas de los individuos enterrados entre la segunda mitad del s. vii d. C. y comienzos del viii d. C. El conjunto monetario tiene una fecha de cierre que remite al periodo de gobierno de al-Ḥakam I (180-206 h./796-822 d. C.). El estudio de este lote numismático en su contexto, la lectura sin dificultad de las leyendas que permiten deducir ver variaciones en las monedas y el análisis de su composición, que en este estudio presentamos, ofrecen datos que contribuyen a comprender mejor la producción y la circulación monetaria emiral en el área central de la Península Ibérica

Influence of Malignant Pleural Fluid from Lung Adenocarcinoma Patients on Neutrophil Response

Malignant pleural effusion (MPE) is a common severe complication of advanced lung adenocarcinoma (LAC). Neutrophils, an essential component of tumor infiltrates, contribute to tumor progression and their counts in MPE have been associated with worse outcome in LAC. This study aimed to evaluate phenotypical and functional changes of neutrophils induced by MPE to determine the influence of MPE immunomodulatory factors in neutrophil response and to find a possible association between neutrophil functions and clinical outcomes. Pleural fluid samples were collected from 47 LAC and 25 heart failure (HF) patients. We measured neutrophil degranulation products by ELISA, oxidative burst capacity and apoptosis by flow cytometry, and NETosis by fluorescence. The concentration of degranulation products was higher in MPE-LAC than in PE-HF. Functionally, neutrophils cultured with MPE-LAC had enhanced survival and neutrophil extracellular trap (NET) formation but had reduced oxidative burst capacity. In MPE, NETosis was positively associated with MMP-9, P-selectin, and sPD-L1 and clinically related to a worse outcome. This is the first study associating NETs with a worse outcome in MPE. Neutrophils likely contribute to tumor progression through the release of NETs, suggesting that they are a potential therapeutic target in LAC

Influence of Malignant Pleural Fluid from Lung Adenocarcinoma Patients on Neutrophil Response

Altres ajuts: Merck KGaA, Darmstadt, Germany; Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS).Malignant pleural effusion (MPE) is a common severe complication of advanced lung ad-enocarcinoma (LAC). Neutrophils, an essential component of tumor infiltrates, contribute to tumor progression and their counts in MPE have been associated with worse outcome in LAC. This study aimed to evaluate phenotypical and functional changes of neutrophils induced by MPE to determine the influence of MPE immunomodulatory factors in neutrophil response and to find a possible association between neutrophil functions and clinical outcomes. Pleural fluid samples were col-lected from 47 LAC and 25 heart failure (HF) patients. We measured neutrophil degranulation products by ELISA, oxidative burst capacity and apoptosis by flow cytometry, and NETosis by fluores-cence. The concentration of degranulation products was higher in MPE-LAC than in PE-HF. Func-tionally, neutrophils cultured with MPE-LAC had enhanced survival and neutrophil extracellular trap (NET) formation but had reduced oxidative burst capacity. In MPE, NETosis was positively associated with MMP-9, P-selectin, and sPD-L1 and clinically related to a worse outcome. This is the first study associating NETs with a worse outcome in MPE. Neutrophils likely contribute to tumor progression through the release of NETs, suggesting that they are a potential therapeutic target in LAC

The role of mesenchymal stem cell products in experimental asthma

L'asma es una malaltia inflamatòria crònica que afecta aproximadament a 300 milions de persones en tot el mon. Aquesta malaltia es caracteritza principalment per un conjunt d'alteracions estructurals en les vies respiratòries, conegudes amb el terme de "remodelació", el qual s'ha associat amb la severitat de la malaltia. De totes aquestes alteracions, l'augment de la massa de musculatura llisa induït per una hiperplàsia e hipertrofia de cèl·ules musculars llises (ASM), es el factor de major importància degut a la seva influencia sobre la obstrucció irreversible del flux i la hiperreactivitat de les vies respiratòries. Actualment, el tractament de l'asma es basa en el control de la inflamació, sense efecte demostrat sobre aquesta remodelació irreversible. L'únic tractament capaç d'actuar sobre aquesta l'alteració es la termoplàstia invasiva, amb un cost-efectivitat discutit i diversos fracassos terapèutics. En aquest context, les cèl·ules mare mesenquimals (MSC) exerceixen efectes inmunoreguladors de potencial interès terapèutic en la remodelació bronquial. No obstant, la seva infusió com a teràpia crònica s'enfronta a la possibilitat de que a traves del seu reclutament i diferenciació puguin participar en la remodelació bronquial, particularment en l'augment de la musculatura llisa. D'altra banda, dades addicionals obtingudes en asma experimental suggereixen que l'efecte terapèutic anti-remodelador de les MSC estan vehiculats per mediadors. Per tant, existeix d'una banda la necessitat d'entendre els mecanismes immunològics involucrats en el procés de remodelació i d'altra banda el desenvolupament de models animals de malaltia experimental amb capacitat de reproduir els mecanismes biològics amb un detall i profunditat lo mes similar possible als humans i permetre una millora en la comprensió i tractament de l'asma. Per tot això, en el present treball de tesis doctoral es va proposar desenvolupar un model d'asma al·èrgica basat en l'exposició local d'un al·ergen, i estudiar en aquest model la possible implicació de les MSC sobre les ASM in vitro. Addicionalment, es van estudiar els mecanismes immunològics de les MSC com a teràpia supressora sobre l'alteració estructural mitjançant sistemes de co-cultiu in vitro i en models desenvolupats in vivo. Els resultats obtinguts van demostrar un paper inductor de les cèl·ules T CD4+ al·ergen-especifiques en la remodelació de la musculatura llisa mitjançant mecanismes de contacte directe, la qual es va mesurar amb un anàlisis del cicle cel·ular per citometria de flux. Addicionalment, les MSC tenen la capacitat d'inhibir la proliferació de les ASM induïdes per cèl·ules T CD4+ nomes quan estan separades mitjançant una membrana permeable "Transwell" i es troben en ratios elevats (MSC:limfòcit). Es va observar que l'efecte supressor no estava vehiculat per exosomes i era secretat espontàniament sense prèvia senyalització. Així mateix, únicament els factors solubles compresos en un rang 30 a 100 kDa de pes molecular en aquest medi condicionat (CM) tenen la capacitat de induir aquest efecte supressor sobre les ASM. Aquest CM (30-100 kDa) generat, va ser testat a diferents dosis in vivo en el model desenvolupat amb anterioritat, i es va observar un efecte supressor en els mecanismes immunològics i el procés de remodelació únicament quan es tractaven als animals amb dosis baixes repetides de CM. Aquest efecte es generat per una possible desviació de la resposta immunitària d'un fenotip característic Th2 en asma al·èrgic, cap a un fenotip Th1/Th17 en les vies respiratòries. En aquest context, el CM de les MSC es postula com una estratègia terapèutica propicia sobre la reversió de la remodelació bronquial degut a una desviació en la resposta immunitària.El asma es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta aproximadamente a unos 300 millones de personas en todo el mundo. Esta enfermedad se caracteriza principalmente por un conjunto de alteraciones estructurales en las vías respiratorias, conocidos mediante el término de "remodelación", el cual se ha asociado con la severidad de la enfermedad. De entre estas alteraciones, el aumento de la masa de musculo liso inducido por una hiperplasia e hipertrofia de células musculares lisas (ASM), es el factor considerado de mayor importancia debido a su influencia sobre la obstrucción irreversible del flujo aéreo y a la hiperreactividad de las vías respiratorias. Actualmente, el tratamiento del asma se basa en el control de la inflamación, sin efecto demostrado sobre el mecanismo de remodelación irreversible. El único tratamiento capaz de actuar sobre esta alteración es la termoplastia invasiva, con coste-efectividad discutido y varios fracasos terapéuticos. En este contexto, las células madre mesenquimales (MSC) ejercen efectos inmunoreguladores de potencial interés terapéutico en la remodelación bronquial. Sin embargo, su infusión como terapia crónica se enfrenta a la posibilidad de que a través de su reclutamiento y diferenciación puedan participar en la remodelación de las vías respiratorias, particularmente en el crecimiento del musculo liso. Por otra parte, datos adicionales obtenidos en asma experimental sugieren que el efecto terapéutico anti-remodelador de las MSC esta vehiculados por mediadores. Por tanto, existe por una parte la necesidad de comprender los mecanismos inmunológicos que contribuyen en el proceso de remodelación y por otra parte el desarrollo de modelos animales de enfermedad experimental capaces de reproducir los mecanismos biológicos con un detalle y profundidad los más similar posible en sujetos humanos y permitir una mejor comprensión y tratamiento del asma. Por todo ello, en el presente trabajo de tesis doctoral se propuso desarrollar un modelo de asma alérgica basado en la exposición local de un alérgeno, y estudiar en este modelo la posible implicación de las MSC sobre la remodelación del musculo bronquial in vitro. Adicionalmente, se estudió los mecanismos inmunomoduladores de las MSC como terapia supresora sobre esta alteración estructural mediante sistemas de co-cultivo in vitro y en el modelo desarrollado in vivo. Los resultados obtenidos demostraron un papel inductor de las células T CD4+ alérgeno-especificas en la remodelación del musculo liso mediante un mecanismo de contacto directo, la cual se midió mediante análisis de ciclo celular por citometría de flujo. Adicionalmente, las MSC son capaces de inhibir la proliferación de las ASM inducidas por células T CD4+ solamente cuando están separados mediante una membrana permeable "Transwell" y se encuentran en ratios elevados (MSC:linfocito). Además, se observó que este efecto supresor no estaba vehiculado por exosomas y era secretado espontáneamente sin previa señalización requerida. Asimismo, solamente los factores solubles comprendidos en un rango de 30 a 100 kDa de peso molecular que conforman este medio condicionado (CM) son capaces de inducir este efecto supresor sobre las ASM. Este CM (30-100 kDa) obtenido fue testado a diferentes dosis in vivo en el modelo desarrollado con anterioridad, observándose un efector supresor en los mecanismos inmunológicos y el proceso de remodelación solamente cuando se trataban a los animales con dosis bajas repetidas de CM. Este efecto es generado por una posible desviación de la respuesta inmunitaria de un fenotipo característico Th2 en asma alérgico, hacia un fenotipo Th1/Th17 en las vías respiratorias. Por tanto, el CM de las MSC se postula como una estrategia terapéutica prometedora sobre la reversión de la remodelación bronquial debido a una desviación de la respuesta inmunitaria.Asthma is a chronic inflammatory disease that affects approximately 300 million people worldwide. During the last decades, its prevalence, morbidity, and mortality have increased especially in industrialized countries. This disease is mainly characterized by a set of structural alterations in the respiratory tract, defined by the term "remodeling", which has been associated with the severity of the disease. Among these alterations, the increase in smooth muscle mass induced by hyperplasia and hypertrophy of smooth muscle cells are crucial factors due to their influence on irreversible airflow obstruction and airway hyperreactivity. Currently, asthma treatments based on the control of inflammation have not demonstrated relevant effects on the remodeling mechanism. The only treatment with the capacity to act on this alteration is invasive thermoplasty, with controversial cost-effectiveness and therapeutic failures. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have a potential therapeutic interest in bronchial remodeling due to their immunoregulatory effects. However, their infusion as a chronic therapy may induce recruitment and differentiation of these cells, which may then participate in airway remodeling, particularly in the smooth muscle growth. However, data from experimental asthma models suggest an anti-remodeling therapeutic effect of MSC, carried by soluble mediators. There is, therefore, a need to understand the immunological mechanisms that contribute to the remodeling process and develop experimental animal models capable of reproducing the physiopathological mechanisms as closely as possible to humans, to provide a better understanding and treatment of asthma. In the present doctoral thesis, it was proposed to develop an allergic asthma model based on primary airway exposure to allergen, to study the implication of MSC in airway remodeling in vitro. Additionally, the immunomodulatory mechanisms of the MSC were studied as a suppressive therapy on airway smooth muscle remodeling by in vitro co-culture systems, and in the in vivo model developed. The results obtained demonstrate a significant role of allergen-specific CD4+ T cells in smooth muscle proliferation through direct cell contact, which was measured by cell cycle analysis through flow cytometry. Additionally, MSC are able to inhibit smooth muscle cell proliferation induced by CD4+ T cells only when they were separated by "Transwell" permeable membranes, and were at high MSC: lymphocyte ratios. Moreover, it was observed that such suppressive effect was not carried by exosomes but mediated by secreted, soluble molecules without prior signaling. Only soluble factors in a range of 30 to 100 kDa molecular weight of MSC-conditioned medium (CM) are capable of suppress smooth muscle cell proliferation. This 30-100-kDa CM, when tested at different doses in vivo in the asthma model, demonstrated a suppressive effect on inflammation and airway remodeling, provided that the animals were treated with repeated low-dose CM. This effect was possibly generated by a deviation of the Th2 immune response towards a Th1/Th17 phenotype in the respiratory tract. In this context, the MSC CM is postulated as a promising therapeutic strategy to reverse airway remodeling through a deviation of the immune response

The role of mesenchymal stem cell products in experimental asthma

L’asma es una malaltia inflamatòria crònica que afecta aproximadament a 300 milions de persones en tot el mon. Aquesta malaltia es caracteritza principalment per un conjunt d’alteracions estructurals en les vies respiratòries, conegudes amb el terme de “remodelació”, el qual s’ha associat amb la severitat de la malaltia. De totes aquestes alteracions, l’augment de la massa de musculatura llisa induït per una hiperplàsia e hipertrofia de cèl·ules musculars llises (ASM), es el factor de major importància degut a la seva influencia sobre la obstrucció irreversible del flux i la hiperreactivitat de les vies respiratòries. Actualment, el tractament de l’asma es basa en el control de la inflamació, sense efecte demostrat sobre aquesta remodelació irreversible. L’únic tractament capaç d’actuar sobre aquesta l’alteració es la termoplàstia invasiva, amb un cost-efectivitat discutit i diversos fracassos terapèutics. En aquest context, les cèl·ules mare mesenquimals (MSC) exerceixen efectes inmunoreguladors de potencial interès terapèutic en la remodelació bronquial. No obstant, la seva infusió com a teràpia crònica s’enfronta a la possibilitat de que a traves del seu reclutament i diferenciació puguin participar en la remodelació bronquial, particularment en l’augment de la musculatura llisa. D’altra banda, dades addicionals obtingudes en asma experimental suggereixen que l’efecte terapèutic anti-remodelador de les MSC estan vehiculats per mediadors. Per tant, existeix d’una banda la necessitat d’entendre els mecanismes immunològics involucrats en el procés de remodelació i d’altra banda el desenvolupament de models animals de malaltia experimental amb capacitat de reproduir els mecanismes biològics amb un detall i profunditat lo mes similar possible als humans i permetre una millora en la comprensió i tractament de l’asma. Per tot això, en el present treball de tesis doctoral es va proposar desenvolupar un model d’asma al·èrgica basat en l’exposició local d’un al·ergen, i estudiar en aquest model la possible implicació de les MSC sobre les ASM in vitro. Addicionalment, es van estudiar els mecanismes immunològics de les MSC com a teràpia supressora sobre l’alteració estructural mitjançant sistemes de co-cultiu in vitro i en models desenvolupats in vivo. Els resultats obtinguts van demostrar un paper inductor de les cèl·ules T CD4+ al·ergen-especifiques en la remodelació de la musculatura llisa mitjançant mecanismes de contacte directe, la qual es va mesurar amb un anàlisis del cicle cel·ular per citometria de flux. Addicionalment, les MSC tenen la capacitat d’inhibir la proliferació de les ASM induïdes per cèl·ules T CD4+ nomes quan estan separades mitjançant una membrana permeable “Transwell” i es troben en ratios elevats (MSC:limfòcit). Es va observar que l’efecte supressor no estava vehiculat per exosomes i era secretat espontàniament sense prèvia senyalització. Així mateix, únicament els factors solubles compresos en un rang 30 a 100 kDa de pes molecular en aquest medi condicionat (CM) tenen la capacitat de induir aquest efecte supressor sobre les ASM. Aquest CM (30-100 kDa) generat, va ser testat a diferents dosis in vivo en el model desenvolupat amb anterioritat, i es va observar un efecte supressor en els mecanismes immunològics i el procés de remodelació únicament quan es tractaven als animals amb dosis baixes repetides de CM. Aquest efecte es generat per una possible desviació de la resposta immunitària d’un fenotip característic Th2 en asma al·èrgic, cap a un fenotip Th1/Th17 en les vies respiratòries. En aquest context, el CM de les MSC es postula com una estratègia terapèutica propicia sobre la reversió de la remodelació bronquial degut a una desviació en la resposta immunitària.El asma es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta aproximadamente a unos 300 millones de personas en todo el mundo. Esta enfermedad se caracteriza principalmente por un conjunto de alteraciones estructurales en las vías respiratorias, conocidos mediante el término de “remodelación”, el cual se ha asociado con la severidad de la enfermedad. De entre estas alteraciones, el aumento de la masa de musculo liso inducido por una hiperplasia e hipertrofia de células musculares lisas (ASM), es el factor considerado de mayor importancia debido a su influencia sobre la obstrucción irreversible del flujo aéreo y a la hiperreactividad de las vías respiratorias. Actualmente, el tratamiento del asma se basa en el control de la inflamación, sin efecto demostrado sobre el mecanismo de remodelación irreversible. El único tratamiento capaz de actuar sobre esta alteración es la termoplastia invasiva, con coste-efectividad discutido y varios fracasos terapéuticos. En este contexto, las células madre mesenquimales (MSC) ejercen efectos inmunoreguladores de potencial interés terapéutico en la remodelación bronquial. Sin embargo, su infusión como terapia crónica se enfrenta a la posibilidad de que a través de su reclutamiento y diferenciación puedan participar en la remodelación de las vías respiratorias, particularmente en el crecimiento del musculo liso. Por otra parte, datos adicionales obtenidos en asma experimental sugieren que el efecto terapéutico anti-remodelador de las MSC esta vehiculados por mediadores. Por tanto, existe por una parte la necesidad de comprender los mecanismos inmunológicos que contribuyen en el proceso de remodelación y por otra parte el desarrollo de modelos animales de enfermedad experimental capaces de reproducir los mecanismos biológicos con un detalle y profundidad los más similar posible en sujetos humanos y permitir una mejor comprensión y tratamiento del asma. Por todo ello, en el presente trabajo de tesis doctoral se propuso desarrollar un modelo de asma alérgica basado en la exposición local de un alérgeno, y estudiar en este modelo la posible implicación de las MSC sobre la remodelación del musculo bronquial in vitro. Adicionalmente, se estudió los mecanismos inmunomoduladores de las MSC como terapia supresora sobre esta alteración estructural mediante sistemas de co-cultivo in vitro y en el modelo desarrollado in vivo. Los resultados obtenidos demostraron un papel inductor de las células T CD4+ alérgeno-especificas en la remodelación del musculo liso mediante un mecanismo de contacto directo, la cual se midió mediante análisis de ciclo celular por citometría de flujo. Adicionalmente, las MSC son capaces de inhibir la proliferación de las ASM inducidas por células T CD4+ solamente cuando están separados mediante una membrana permeable “Transwell” y se encuentran en ratios elevados (MSC:linfocito). Además, se observó que este efecto supresor no estaba vehiculado por exosomas y era secretado espontáneamente sin previa señalización requerida. Asimismo, solamente los factores solubles comprendidos en un rango de 30 a 100 kDa de peso molecular que conforman este medio condicionado (CM) son capaces de inducir este efecto supresor sobre las ASM. Este CM (30-100 kDa) obtenido fue testado a diferentes dosis in vivo en el modelo desarrollado con anterioridad, observándose un efector supresor en los mecanismos inmunológicos y el proceso de remodelación solamente cuando se trataban a los animales con dosis bajas repetidas de CM. Este efecto es generado por una posible desviación de la respuesta inmunitaria de un fenotipo característico Th2 en asma alérgico, hacia un fenotipo Th1/Th17 en las vías respiratorias. Por tanto, el CM de las MSC se postula como una estrategia terapéutica prometedora sobre la reversión de la remodelación bronquial debido a una desviación de la respuesta inmunitaria.Asthma is a chronic inflammatory disease that affects approximately 300 million people worldwide. During the last decades, its prevalence, morbidity, and mortality have increased especially in industrialized countries. This disease is mainly characterized by a set of structural alterations in the respiratory tract, defined by the term “remodeling”, which has been associated with the severity of the disease. Among these alterations, the increase in smooth muscle mass induced by hyperplasia and hypertrophy of smooth muscle cells are crucial factors due to their influence on irreversible airflow obstruction and airway hyperreactivity. Currently, asthma treatments based on the control of inflammation have not demonstrated relevant effects on the remodeling mechanism. The only treatment with the capacity to act on this alteration is invasive thermoplasty, with controversial cost-effectiveness and therapeutic failures. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have a potential therapeutic interest in bronchial remodeling due to their immunoregulatory effects. However, their infusion as a chronic therapy may induce recruitment and differentiation of these cells, which may then participate in airway remodeling, particularly in the smooth muscle growth. However, data from experimental asthma models suggest an anti-remodeling therapeutic effect of MSC, carried by soluble mediators. There is, therefore, a need to understand the immunological mechanisms that contribute to the remodeling process and develop experimental animal models capable of reproducing the physiopathological mechanisms as closely as possible to humans, to provide a better understanding and treatment of asthma. In the present doctoral thesis, it was proposed to develop an allergic asthma model based on primary airway exposure to allergen, to study the implication of MSC in airway remodeling in vitro. Additionally, the immunomodulatory mechanisms of the MSC were studied as a suppressive therapy on airway smooth muscle remodeling by in vitro co-culture systems, and in the in vivo model developed. The results obtained demonstrate a significant role of allergen-specific CD4+ T cells in smooth muscle proliferation through direct cell contact, which was measured by cell cycle analysis through flow cytometry. Additionally, MSC are able to inhibit smooth muscle cell proliferation induced by CD4+ T cells only when they were separated by “Transwell” permeable membranes, and were at high MSC: lymphocyte ratios. Moreover, it was observed that such suppressive effect was not carried by exosomes but mediated by secreted, soluble molecules without prior signaling. Only soluble factors in a range of 30 to 100 kDa molecular weight of MSC-conditioned medium (CM) are capable of suppress smooth muscle cell proliferation. This 30-100-kDa CM, when tested at different doses in vivo in the asthma model, demonstrated a suppressive effect on inflammation and airway remodeling, provided that the animals were treated with repeated low-dose CM. This effect was possibly generated by a deviation of the Th2 immune response towards a Th1/Th17 phenotype in the respiratory tract. In this context, the MSC CM is postulated as a promising therapeutic strategy to reverse airway remodeling through a deviation of the immune response.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Immunologia Avançad

Effector Mechanisms of CD8+ HLA-DR+ T Cells in Breast Cancer Patients Who Respond to Neoadjuvant Chemotherapy

Cytotoxic T lymphocyte (CTLs) activation is an independent predictor of response to neoadjuvant chemotherapy (NACT) in breast cancer (BC) patients. Here, we go deeper into the function of CD8+ HLA-DR+ T cells from NACT treated HER2 negative BC patients. Flow cytometry analysis revealed that CD8+ HLA-DR+ T cell percentage was increased in NACT responder (R) compared to non-responder (NR) patients. R patients with ER-/PR- hormone receptors had the highest CD8+ HLA-DR+ T cell frequencies, while no differences were found when patients were classified according to cancer stage or menopause status. Interestingly, the cytotoxicity and production of anti-tumor cytokines were enhanced when CD8+ HLA-DR+ T cells from healthy donors were cultured with plasma from R, but not from NR patients. The induced anti-tumor profile of CD8+ HLA-DR+ T cells was associated with plasmatic IL-12 and IFN-γ levels, increased cytokines in R patients. IL-12 or IFN-γ neutralization decreased cytotoxic activity and TNF-α production by cultured CD8+ HLA-DR+ T cells in R plasma presence. All these data suggest that an effective response to NACT in BC patients is associated with increased IL-12 or IFN-γ levels involved in the induction of cytotoxic and pro-inflammatory mechanisms in CD8+ HLA-DR+ T cells