The cold-sensing ion channel TRPM8 regulates central and peripheral clockwork and the circadian oscillations of body temperature

[Abstract] Aim: Physiological functions in mammals show circadian oscillations, synchronized by daily cycles of light and temperature. Central and peripheral clocks participate in this regulation. Since the ion channel TRPM8 is a critical cold sensor, we investigated its role in circadian function. Methods: We used TRPM8 reporter mouse lines and TRPM8-deficient mice. mRNA levels were determined by in situ hybridization or RT-qPCR and protein levels by immunofluorescence. A telemetry system was used to measure core body temperature (Tc). Results: TRPM8 is expressed in the retina, specifically in cholinergic amacrine interneurons and in a subset of melanopsin-positive ganglion cells which project to the central pacemaker, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. TRPM8-positive fibres were also found innervating choroid and ciliary body vasculature, with a putative function in intraocular temperature, as shown in TRPM8-deficient mice. Interestingly, Trpm8-/- animals displayed increased expression of the clock gene Per2 and vasopressin (AVP) in the SCN, suggesting a regulatory role of TRPM8 on the central oscillator. Since SCN AVP neurons control body temperature, we studied Tc in driven and free-running conditions. TRPM8-deficiency increased the amplitude of Tc oscillations and, under dim constant light, induced a greater phase delay and instability of Tc rhythmicity. Finally, TRPM8-positive fibres innervate peripheral organs, like liver and white adipose tissue. Notably, Trpm8-/- mice displayed a dysregulated expression of Per2 mRNA in these metabolic tissues. Conclusion: Our findings support a function of TRPM8 as a temperature sensor involved in the regulation of central and peripheral clocks and the circadian control of Tc.Ministerio de Ciencia e Innovación (España); RT2018-099995-B100Ministerio de Ciencia e Innovación (España); AEI/10.13039/501100011033Generalitat Valenciana; PROMETEO/2021/031Ministerio de Asuntos Económicos y Transformación Digital (España); BES-2011-04706

Caracterización de líneas transgénicas murinas para el canal iónico termosensible TRPM8: valoración funcional, expresión extraganglionar e identificación de nuevas dianas de inervación

El canal iónico TRPM8 (“Transient Receptor Potential Melastatin 8”) se activa por descensos moderados de la temperatura y por compuestos químicos como el mentol, que evocan sensaciones de frescor. Estudios previos han demostrado su papel crucial en la detección somatosensorial del frío inocuo, aunque también se relaciona con la detección del frio nocivo y la nocicepción. Asimismo, en estudios recientes se ha asociado con la termorregulación y con la regulación del metabolismo energético. Su principal lugar de expresión se circunscribe a un subgrupo de neuronas sensoriales de pequeño tamaño, mayormente ubicadas en los ganglios raquídeos y del trigémino. Aunque se ha descrito su presencia en otros tejidos del organismo, no existe ningún estudio sistemático de su expresión, lo que ayudaría a entender su papel fisiológico. Uno de los principales impedimentos para el estudio de TRPM8 reside en la falta de buenos anticuerpos que localicen su presencia de manera clara y veraz. En este contexto, en los últimos años se han generado varios modelos transgénicos murinos que permiten la detección de su expresión mediante proteínas reporteras, y que han demostrado ser de gran utilidad para el estudio de su función. En este trabajo de tesis doctoral, hemos evaluado la fiabilidad de siete líneas transgénicas de ratón que expresan reporteros fluorescentes para ubicar la expresión del canal iónico TRPM8. Algunas de estas líneas se han utilizado en trabajos de investigación previos (TRPM8-EYFP1, TRPM8-EGFPf, TRPM8-Cre, TRPM8-DTR-GFP), mientras que otras (TRPM8-EYFP2, TRPM8-EYFP3 y TRPM8-EYFP4), generadas en nuestro laboratorio, son totalmente novedosas. Hemos realizado un estudio comparativo de la expresión del reportero y de la respuesta del canal TRPM8 a fármacos moduladores de su actividad en neuronas sensoriales en las distintas líneas estudiadas. Así hemos concluido que casi todos los modelos muestran una buena correlación entre el marcaje del reportero y la expresión funcional del termorreceptor, lo que indica que constituyen unas buenas herramientas para el estudio de la anatomía y fisiología del canal. La única excepción fue la línea TRPM8-Cre, en la que demostramos una baja correlación entre expresión y función, lo que limita su utilidad. Además, la línea TRPM8-EYFP1 mostró una alta intensidad de marcaje fluorescente, que se detectó variable entre sus células. El estudio sistemático de estas diferencias nos llevó a establecer que el reportero de esta línea transgénica identifica dos subpoblaciones de neuronas termosensibles pero con características morfológicas, funcionales y niveles de expresión de TRPM8 distintos. En consecuencia, este modelo fue seleccionado para desarrollar un estudio tisular generalizado, para localizar ubicaciones de expresión e inervación de TRPM8 en emplazamientos extraganglionares. De este modo, verificamos algunas de las dianas ya indicadas en la bibliografía e identificamos algunas novedosas que estudiamos en más profundidad. Hemos estudiado en detalle la expresión del canal TRPM8 al nivel del sistema nervioso central de ratón, identificando neuronas positivas en unas pocas localizaciones, principalmente núcleos del hipotálamo preóptico, el septum y el núcleo reticular del tálamo. Estas áreas se relacionan principalmente con la termorregulación y otros procesos homeostáticos relacionados con la temperatura. Igualmente, se observó una amplia distribución de sus dianas de inervación, lo que sugiere la implicación de TRPM8 en múltiples procesos regulatorios a nivel central aún no descritos. Hemos estudiado la osmorregulación como uno de estos procesos, y hemos determinado que TRPM8 influye indirectamente en el nivel de activación del órgano vascular de la lámina terminal y del órgano subfornical, principales núcleos osmorreguladores cerebrales. Finalmente, caracterizamos la presencia del canal TRPM8 en retina. Los patrones de marcaje observados en las distintas líneas transgénicas evidenciaron su expresión en células amacrinas colinérgicas y en células ganglionares, algunas de ellas positivas para el fotopigmento melanopsina. Asimismo, se observó que las proyecciones ganglionares retinianas con marcaje llegaban a todos los núcleos cerebrales implicados en la vía visual, tanto la formadora como la no formadora de imágenes. Sin embargo, no logramos detectar su ARNm en la retina, lo que nos lleva a concluir que sus niveles de expresión en esta ubicación serían extremadamente bajos. En conclusión, en este trabajo se caracterizan nuevas herramientas moleculares para estudiar la expresión del canal TRPM8, evaluándose en profundidad algunas de las nuevas dianas detectadas. Además, los resultados permiten ofrecer una visión global de las implicaciones fisiológicas de este termorreceptor. Futuros análisis de la función de TRPM8 en estos y otros tejidos que lo expresan ayudarán a completar el rompecabezas de sus implicaciones homeostáticas

Relationship between Delayed Leaf Senescence (Stay-Green) and Agronomic and Physiological Characters in Maize (Zea mays L.)

Stay-green (SG) is a term used to describe genotypes that have delayed leaf senescence as compared to reference genotypes. SG could be favorable for grain yield, silage yield and quality, double exploitation (grain for feed and stover for bioenergy), stress resistance, etc. However, some studies show contradictory results regarding the influence of senescence or SG in the uptake and remobilization of nutrients and the yield and moisture of stover and grain. This experiment is aimed to study the impact of senescence in grain and stover yield and moisture in inbred lines of maize and assess the potential of SG genotypes for double exploitation. We also study the influence of senescence in the uptake of N and remobilization of dry matter and N from stover to grain. We evaluated 16 maize inbred lines with contrasting expression of senescence in the field at two locations in Galicia in 2017. We confirmed that SG is functional, meaning that the SG genotypes maintained photosynthesis activity for a lengthy period. Coordinated with a delayed senescence, the grain filling of the SG genotypes was 9 days longer than NSG genotypes. SG genotypes took up more N after flowering, although the remobilization of N and, in general, of dry matter from stover to kernels was less efficient. However, the higher uptake compensated the poor remobilization, and the final effect of SG on the N content of the kernels was favorable. SG was also favorable for kernel weight and the kernels of SG genotypes were 20% heavier than for NSG. The stover yield was also higher in the SG genotypes, indicating a potential of SG for breeding for double purpose (grain for feed and stover for bioenergy).This research was funded by a grant from the “Xunta de Galicia” (Project IN607D 2016/002).Peer reviewe