Semi-automated repetitive sequence-based PCR amplification for species of the Scedosporium apiospermum complex

International audiencePurpose: The Scedosporium apiospermum species complex usually ranks second among the filamentous fungi colonizing the airways of patients with cystic fibrosis (CF), but little is known about the molecular epidemiology of the airway colonization.Methods: Polymerase chain reaction (PCR) amplification of repetitive sequences (rep-PCR) was applied to the retrospective analysis of a panel of isolates already studied by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and comprising 63 isolates recovered from sputa from 9 CF patients. Results were compared to those obtained previously by RAPD, and herein by beta-tubulin (TUB) gene sequencing and Multilocus Sequence Typing (MLST).Results: Within the panel of isolates studied, S. apiospermum sensu stricto and Sce-dosporium boydii, as expected, were the predominant species with 21 and 36 isolates, respectively. Four isolates from one patient were identified as Scedosporium auranti-acum, whereas two isolates belonged to the Pseudallescheria ellipsoidea subgroup of S. boydii. rep-PCR analysis of these isolates clearly differentiated the three species and P. ellipsoidea isolates, whatever the rep-PCR kit used, and also permitted strain differentiation. When using the mold primer kit, results from rep-PCR were in close agreement with those obtained by MLST. For both S. apiospermum and S. boydii, 8 genotypes were differentiated by rep-PCR and MLST compared to 10 by RAPD. All S. aurantiacum isolates shared the same RAPD genotype and exhibited the same rep-PCR profile and sequence type.Conclusions: These results illustrate the efficacy of rep-PCR for both species identification within the S. apiospermum complex and genotyping for the two major species of this comple

Ingénierie écologique des communautés microbiennes de méthanisation des déchets ligno-cellulosiques

Dans le but d'évaluer la possibilité de mise en place une ingénierie écologique des processus microbiens de la digestion anaérobie dans les bioprocédés, différents leviers environnementaux ont été appliqués à des digesteurs de cellulose. Le premier levier étudié, de nature physico-chimique, était la température. Le deuxième faisait appel à une adaptation préalable d'une biomasse complexe par incubation avec des molécules simples avant mise en présence de cellulose. Le dernier consistait en la co-inoculation de diverses biomasses exogènes avec une boue anaérobie. Les conséquences des perturbations apportées par ces leviers sur les dynamiques métaboliques et écologiques de bioréacteurs anaérobies dégradant de la cellulose ont été évaluées. Différents indicateurs physico-chimiques ont été utilisés pour caractériser la dégradation de la cellulose (production de molécules intermédiaires, production de gaz, etc.). Les outils de la biologie moléculaire ont permis de caractériser les dynamiques microbiennes à l'échelle des communautés (par fingerprinting ARISA) ou des individus (par pyroséquençage de l'ADNr 16S). L'utilisation d'isotopes stables (cellulose marquée 13C), a permis de réaliser un traçage précis des flux de matières (intermédiaires de dégradation de la cellulose enrichis en 13C) et des microorganismes impliqués dans la chaîne de dégradation de la cellulose (groupes microbiens fonctionnels identifiés par la technique de stable isotope probing ). Les expériences de changements de température ont montrél'influence importante de ce paramètre sur les communautés microbiennes, en particulier les archées. Elles ont mis en évidence le caractère asymétrique de l'effet de la température sur les communautés microbiennes et les conséquences irréversibles du passage par les conditions thermophiles. Ces propriétés ouvrent des perspectives intéressantes pour exploiter les chocs de température afin de modifier les propriétés de la biomasse. L'expérience de fonctionnalisation de la biomasse à l'aide de quatre molécules simples (acide propionique, acide butyrique, glucose et cellobiose) montre qu'un modelage des populations microbiennes par préadaptation est possible. Une fois en contact avec la cellulose, les biomasses fonctionnalisées génèrent des schémas de dégradation et des structures de communautés qui se répartissent de manière inattendue en deux catégories seulement. Ce résultat suggère qu'il est possible d'orienter les états d'équilibre d'une communauté microbienne complexe par préadaptation fonctionnelle. Enfin, des expériences de co-inoculation ont mis en avant la difficulté d'exploiter directement les propriétés enzymatiques de flores cellulolytiques performantes mais également les possibilités de modifier les équilibres de diversité au sein de la biomasse du bioprocédé. Ces expériences suggèrent qu'un paramètre tel que la diversité de la communauté d'un bioprocédé pourrait être manipulé par bioaugmentation. Ce travail démontre que nous disposons d'ores et déjà d'un certain nombre d'outils pour élaborer une ingénierie écologique des bioprocédés à travers une nouvelle démarche de gestion qui se place à l'échelle de l'écosystème microbien et des services associés.In order to evaluate the possibility of establishing an ecological engineering of microbial processes of anaerobic digestion in bioprocesses, different environmental levers were applied to cellulose digesters. The first lever studied was temperature. The second involved preadaptation of a complex biomass by incubation with simple molecules, before addition of cellulose. The third lever consisted in co-inoculating various exogenous biomasses with anaerobic sludge. The consequences of these levers on metabolic and ecological dynamics of cellulose-degrading anaerobic bioreactors were evaluated. Different physicochemical indicators were used to characterize cellulose degradation (intermediate production, gas production, etc.). Molecular biology tools enabled the characterization of microbial dynamics at the community level (ARISA fingerprinting) or individual level (16S rDNA pyrosequencing ). The use of stable isotopes (13C-labeled cellulose) enabled the accurate tracing of both material flows (13C enriched cellulose intermediates) and microorganisms involved in the cellulose degradation chain (functional microbial groups were identified by "stable isotope probing" technique). Temperature changes showed the significant influence of this parameter on microbial communities, especially Archaea. The asymmetric nature of temperature effect on microbial communities, and the irreversible consequences of incubation in thermophilic conditions were highlighted. These properties open interesting perspectives for the use of temperature shocks to modify biomass properties. A biomass functionalization experiment was performed with simple molecules (propionic acid, butyric acid, glucose and cellobiose). It showed that shaping microbial communities through substrate adaptation was possible. Once in contact with the cellulose, functionalized biomasses generated patterns and structures of degradation communities who unexpectedly formed two categories only. This result suggests that it is possible to direct the equilibrium states of a complex microbial community by functional preadaptation. Finally, co-inoculation experiments highlighted the difficulty of directly exploiting the enzymatic properties of efficient cellulolytic flora. But, they also highlighted the possibility of changing biomass diversity balance in bioprocesses. Thus these experiments suggest that a parameter such as community diversity can be manipulated by bioaugmentation in bioprocesses. This work demonstrates that several tools are available to develop an ecological engineering of bioprocesses, through a new management approach at the microbial ecosystem (and related services) level.PARIS-AgroParisTech Centre Paris (751052302) / SudocSudocFranceF

Identification and dispersal of composting bioaerosols emitted on composting platforms

Cette étude porte sur l'identification et la dispersion des bioaérosols générés sur les plates-formes de compostage et plus précisément lors du retournement des andains en cours de fermentation. L'analyse des bioaérosols émis sur cinq plates-formes par des inventaires moléculaires (ADNr 16S et ADNr 18S) a permis de montrer la dominance de deux phyla bactériens Firmicutes et Actinobacteria et du phylum fongique Ascomycota. En comparant la structure de la population microbienne des cinq bioaérosols, une signature a été identifiée. Dix phylotypes microbiens sont communs à au moins quatre bioaérosols. Deux sont présents dans les cinq bioaérosols : NA07 appartenant à l'espèce Saccharopolyspora rectivirgula et représentant 7% des séquences bactériennes totales et EQ07 affiliée à Thermomyces (49% des séquences fongiques). Un second phylotype bactérien, NC38, affilié à la famille des Thermoactinomycetaceae a été sélectionné du fait q u'il n'ait été identifié que dans le compost. Des systèmes de PCRq ont été développés pour quantifier ces trois indicateurs potentiels. Ces derniers ont été validés expérimentalement par des mesures sur sites industriels. La dispersion des bioaérosols a ensuite été caractérisée en utilisant plusieurs méthodologies, dont les trois indicateurs conçus et une technique d'empreinte moléculaire, la SSCP. Lors d'une activité de retournement, la concentration des indicateurs est supérieure à leur niveau basal dans l'air (bruit de fond). Les indicateurs présentent des profils de dispersion différents d'où l'intérêt de les coupler afin d'obtenir une meilleure vision de la dispersion des bioaérosols de compostage.The aim of this work was to analyze the diversity and the dispersal of composting bioaerosol emitted during the turning of compost windrows in thermophilic phase on composting platforms. The study of the microbial diversity of aerosols emitted on five composting plants was realized by 16S and 18S rDNA molecular inventories. Two bacterial phyla Firmicutes and Actinobacteria and one fungal phylum Ascomycota dominated. A common microbial signature emerged from the five composting bioaerosols: ten microbial phylotypes (seven bacterial and three fungal) were common to at least four bioaerosols. Two have been identified in five bioaerosols: NA07 belonging to the species Saccharopolyspora rectivirgula, and representing 7% of total number of bacterial sequences, and EQ05,affiliated to Thermomyces (49% of total number of fungal sequences). A second bacterial phylotype, NC38, affiliated to the Thermoactinomycetaceae family, was selected because it was id entified only in the environmental source compost'. qPCR systems were then designed for each phylotype. Measurements performed on industrial composting sites validated the use of these microorganisms as indicators of composting bioaerosols. The dispersal of composting bioaerosols was then characterized using the three indicators developed and a fingerprint technique, the SSCP.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

L'écosystème a-t'il une mémoire ? (importance de l'histoire sur la résilience fonctionnelle de communautés bactériennes hétérotrophes marines et anaérobies)

Nous voulons déterminer si la résilience (définie comme retour à l'état initial après un choc) de consortia microbiens complexes dépend d'une adaptation physiologique et/ou structurelle aux fluctuations environnementales biotiques et abiotiques. Nous avons suivi la minéralisation de la matière organique ainsi que la structure des communautés par empreinte moléculaire dans des chemostats. Il en ressort que les consortia de bactéries marines prélevées sur le littoral ou au large n'ont pas la même résilience fonctionnelle après un choc de toluène. La résilience semble dépendre des propriétés physiologiques d'une souche d'/Alteromonas/ ubiquiste. D'autre part, les fluctuations environnementales sélectionnent des communautés anaérobies. La fonction de ces communautés est écologiquement plus résiliente après un choc acide. Cependant, des chemosats identiques divergent au cours de l'incubation. La sélection n'est donc pas entièrement déterministeLYON1-BU.Sciences (692662101) / SudocBANYULS/MER-Observ.Océanol. (660162201) / SudocSudocFranceF

Unstable environment enhanced ecological resilience in anaerobic digestors

International audienc

Molecular cloning and developmental expression of AtGR1, a new growth-related Arabidopsis gene strongly induced by ionizing radiation

International audienceScreening for mRNAs that accumulate after DNA damage induced by ionizing radiation, we have isolated a 2.0-kb cDNA coding for a new Arabidopsis PEST-box protein named AtGR1 (A. thaliana gamma response 1) with an expression profile similar to that observed for several plant cell cycle-related proteins. Using an anti-AtGR1 antibody, we have shown that the AtGR1 protein is expressed at basal levels in mitotically dividing cells (meristematic tissues and organ primordia) and at a strongly enhanced level in endoreduplicating cells (stipules, trichomes). Using transgenic Arabidopsis plants that express the GUS reporter gene under the control of the AtGR1 promoter, we have demonstrated that the observed AtGR1 protein distribution is due to the promoter activity. Our results suggest that basal AtGR1 levels are associated with progression through mitosis, whereas elevated intracellular levels of AtGR1 seem to induce changes between the S and M phases of the cell cycle that trigger somatic cells to enter the endoreduplication cycle. Ionizing radiation-induced rapid and dose-dependent accumulation of AtGR1 mRNA in cell cultures and plant tissues leads to tissue-specific accumulation of AtGR1 protein, best observed in ovules, which never undergo an endoreduplication cycle. It therefore appears that the radiation-induced transient AtGR1 accumulation reflects DNA damage-dependent transient cell cycle arrest before mitosis, which is necessary to accomplish DNA repair prior to chromosome segregation and cytokinesis

New specific indicators for qPCR monitoring of airborne microorganisms emitted by composting plants

International audienceBioaerosols emitted from composting plants are an issue because of their potential harmful impact on public or workers' health. There is a major lack of knowledge concerning the dispersal of airborne microorganisms emitted by composting plants and the consequent potential exposure of nearby residents. This inadequate knowledge is partly due to the fact that there is currently no method for specifically tracing these microorganisms in the air. The objective of this study was to validate the use of microbial groups as indicators of composting bioaerosols by comparing their concentration in air samples, whether impacted by composting activity or not. Three potential microbial indicators were chosen among the core species of composting bioaerosols. They belong to the genus Saccharopolyspora, to the Thermoactinomycetaceae and to the fungus Thermomyces. Quantitative PCR systems using TaqMan probes were designed to quantify each of the three phylotypes in air samples collected outdoors in natural environments and at composting plants. Compost-turning operations at industrial plants resulted in an increase in the concentration of the three phylotypes of at least 2 orders of magnitude when compared to the concentration measured in control samples collected upwind, and of at least 1 order of magnitude compared to the background concentration measured in natural environments unaffected by industrial activity. In conclusion, these three thermophilic phylotypes can be used as indicators of airborne microorganisms emitted by industrial composting plants. They may be particularly relevant in studying the dispersal of bioaerosols around composting plants and the exposure of nearby residents. This is the first time that indicators of compost bioaerosols have been validated by comparing their concentrations in impacted samples to their background levels in natural environments

Safum: statistical analysis of SSCP fingerprints using PCA projections, dendrograms and diversity estimators

International audienceThe program safum provides a smart interface to import, visualize and compare fingerprinting profiles, especially on capillary electrophoresis single strand conformation polymorphism data, in conjunction with basic statistical analysis tools. It includes principal component analysis, two- or three-dimensional representations, dendrograms based on Euclidean distance, and easily exportable files for subsequent applications. safum is useful for the analysis of spatial or temporal sequences of microbial community fingerprints obtained with an ABI prism sequencer