Phenotype and genotype characterization of Phalaenopsis amabilis (L.) Blume Orchid Transformant Harboring Construct UBI::Cas9::U3::PDS3

Phalaenopsis amabilis (L.) Blume is an Indonesian national “Flower of Charm” (“Puspa Pesona”), an ornamental plant that by using genetic engineering we could improve the flower quality. In this study, Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation and CRISPR/Cas9 genome editing system was used to edit the orchid genome more specific and precisely. Twelve months old putative transgenic plants originated from protocorm like bodies (PLBs) transformation harboring the T-DNA construct UBI::Cas9::U3::PDS3/plasmid pRGEB32. Proofing for the putative transformant plants were stably harboring the T-DNA constructs were conducted by genotype and phenotype characterization. The purpose of this study was to characterize genotypically and phenotypically the putative transformant of P. amabilis harboring T-DNA constructs UBI::Cas9::U3::PDS3 compared to non-transformant. Genotype characterization was carried out by detecting the integration of T-DNA harboring UBI::Cas9::U3::PDS3 on the P. amabilis genome using several primers for HPT, Cas9, PDS3 and trnL-F (internal control primers). Phenotype analysis was carried out by observing and analyzing chlorophyll content using spectrophotometric methods. The results showed that genome of putative P. amabilis transformant age 12 months could be amplified by the primers. Phenotypic analysis of P. amabilis transformant showed a change in plant color from green to pale (albino) with lower chlorophyll content compared to non-transformant. This indicates that the CRISPR/Cas9 technology is able to edit the genome of orchids. Keywords: Chlorophyll, CRISPR/Cas9, orchid, Phalaenopsis amabilis (L.) Blume, PHYTOENE DESATURASE 3 (PDS3), Transformant.Phalaenopsis amabilis (L.) Blume adalah tanaman hias “Puspa Pesona Indonesia” yang dapat ditingkatkan kualitasnya dengan teknik rekayasa genetika. Transformasi genetik dengan perantara Agrobacterium tumefaciens dan CRISPR/Cas9 digunakan dalam penelitian ini untuk pengeditan genom secara lebih spesifik dan presisi pada target sekuen gen PHYTOENE DESATURASE3 (PDS3) yaitu gen yang berperan penting pada biosintesis kloroplas. Dalam penelitian ini digunakan tanaman transforman umur 12 bulan yang ditumbuhkan dari protokorm yang telah diintegrasi dengan T-DNA pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3/plasmid pRGEB32. Pembuktian tanaman transforman tersebut masih mengandung konstruksi T-DNA tersebut perlu dilakukan, yaitu dengan karakterisasi secara genotipe dan fenotipe. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi P. amabilis transforman pembawa T-DNA dengan konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 secara genotip dan fenotip dibandingkan dengan P. amabilis non-transforman. Karakterisasi genotipe dilakukan dengan mendeteksi integrasi T-DNA pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 pada genom anggrek P. amabilis menggunakan beberapa primer yaitu HPT, Cas9, PDS3 dan trnL-F (primer kontrol internal). Analisis karakter fenotipe dilakukan dengan pengamatan morfologi dan analisis kadar klorofil menggunakan metode spektrofotometri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa genom anggrek P. amabilis transforman pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 umur 12 bulan dapat teramplifikasi oleh semua primer. Analisis fenotipe P. amabilis transforman menunjukkan adanya perubahan warna tanaman dari hijau menjadi albino dengan kadar klorofil lebih rendah jika dibandingkan dengan P. amabilis non-transforman. Hal ini menunjukkan bahwa teknologi CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk mengedit genom tanaman anggrek. Kata kunci: Anggrek, CRISPR/Cas9, klorofil, Phalaenopsis amabilis (L.) Blume, PHYTOENE DESATURASE 3 (PDS3), Transforma

Application of CRISPR/Cas9 genome editing system for molecular breeding of orchids

Orchid is an important ornamental plant in Indonesia due to their natural beauty of flowers. In the tropical forest, orchids are being acquired for trading and commercial market. Thus, the effort is required to proliferate orchid in large quantities for conservation and improve the floral variation for plant breeding. The purpose of this study is to develop a firmed methodology of molecular breeding of orchids using CRISPR/Cas9 KO system. The plant material used was Phalaenopsis amabilis protocorms growth on NP medium+pepton (2 g/L). Protocorm were submerged in the culture of Agrobacterium tumefaciens that Ti‐plasmid had been filled with a T‐DNA construct of a pRGEB32 vector harboring sgRNA with PDS3 sequence. Detection for transformants was confirmed by PCR using HPT primers (545 bp), Cas9 primers (402 bp), PDS primers (280 bp) and trnL‐F (1200 bp) as an internal control. The results showed that 0.96% PDS transformants were obtained from PDS3T2 lines. Several transformant showed pale leaf color compared to non‐transformant plants. This study suggests that the target gene has successfully edited by CRISPR/Cas9 system and could be applied for that functional gene editing in orchids

Keanekaragaman Jenis Ikan di Sepanjang Sungai Opak Propinsi Daerah Istimewa Yogyakarta, Indonesia

Penelitian mengenai keanekaragaman ikan air tawar di Sungai Opak DIY telah dilakukan dan dipublikasikan, tahun 2006, 2011 dan 2013. Data mengenai keanekaragaman ikan di Sungai Opak perlu dilakukan penambahan data, terutama data menyeluruh dari hulu hingga muara. Penambahan data perlu dilakukan, karena dimungkinkan ditemukan jenis ikan yang belum sempat tertangkap pada penelitian sebelumnya. Data jenis ikan yang tidak tertangkap pada penelitian sebelumnya, dapat menambah keanekaragaman jenis ikan di Sungai Opak. Penelitian ini bertujuan untuk melengkapi dan menambah data keanekaragaman jenis ikan yang terdapat di sepanjang Sungai Opak, dari hulu hingga muara. Pengambilan sampel dari hulu hingga muara menggunakan metode Purposive Random Sampling dengan bantuan jaring besar, kecil dan jala tebar. Sampling secara umum dibagi dalam empat bagian yaitu: hulu, tengah, hilir dan muara. Pada penelitian yang kami lakukan, terdapat beberapa jenis ikan yang tidak dijumpai pada penelitian sebelumnya, yaitu: lima jenis ikan dibagian hulu, di bagian tengah terdapat tiga jenis ikan yang tidak dijumpai pada penelitian sebelumnya, baik sampling hulu maupun hilir. Di bagian hilir dijumpai tujuh jenis ikan saat penelitian ini dan tidak dijumpai pada penelitian sebelumnya. Pada bagian muara, dijumpai lima belas jenis ikan yang tidak dijumpai di hilir pada penelitian sebelumnya. Total terdapat 28 jenis ikan yang dijumpai di tahun 2013 tetapi belum dijumpai di penelitian sebelumnya