A Multiplex real-time PCR for detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in clinical samples from Brazilian commercial poultry flocks

Mycoplasma gallisepticum (MS) and Mycoplasma synoviae (MS) are important avian pathogens and cause economic losses to the poultry industry. Molecular biology techniques are currently used for a rapid detection of these pathogens and the adoption of control measures of the diseases. The aim of this study was to develop and validate a technique for simultaneous detection of MG and MS by multiplex real time polymerase chain reaction (PCR). The complete assay (Multiplex MGMS) was designed with primers and probes specific for each pathogen and developed to be carried out in a single tube reaction. Vaccines, MG and MS isolates and DNA from other Mycoplasma species were used for the development and validation of the method. Further, 78 pooled clinical samples from different poultry flocks in Brazil were obtained and used to determine the sensitivity and specificity of the technique in comparison to 2 real time PCR assays specific for MG (MG PCR) and MS (MS PCR). The results demonstrated an agreement of 100% (23 positive and 44 negative samples) between Multiplex MGMS and MG PCR in the analysis of 67 samples from MG positive and negative poultry flocks, and an agreement of 96.9% between Multiplex MGMS and MS PCR in the analysis of 64 samples from MS positive and negative poultry flocks. Considering the single amplification tests as the gold standard, the Multiplex MGMS showed 100% of specificity and sensitivity in the MG analysis and 94.7% sensitivity and 100% specificity in the MS analysis. This new assay could be used for rapid analysis of MG and MS in the poultry industry laboratories

Resposta sustentada após 1 ano de interferon isolado ou associado a ribavirina em pacientes com cirrose pelo vírus C

OBJECTIVE: The objective of this study was to assess the rate of end of treatmentcomplete response and sustained response in positive HCV cirrhotic patients thatwere either treated with interferon only, or with interferon in combination with ribavirin.PATIENTS AND METHODS: A total of 33 ambulatory HCV-positive cirrhotic patients,without any other identifiable etiology of liver disease and classified as Child-Pugh Awere divided in a non-randomized manner into the following groups: Group 1 (n=13),treated with subcutaneous doses of interferon (3 UM), three times per week, for 12months; Group 2 (n=20), treated with the same interferon schedule as describedabove, though associated with oral ribavirin (1000 mg/day) twice a day for 12 months.Among the 33 patients, 24 (73%) were male, and the age of all patients ranged from35 to 72 years (mean of 50.7 + 9 years).RESULTS: The rate of end of treatment complete response and of sustained responsefor Group 1 was 1/13 (8%) and 0/13 (0%) respectively, versus 11/20 (55%) and 7/20(35%) for Group 2 (P<0.005). The groups did not differ significantly with respect toage, sex, serum, serum ferritin, gamaglutamyl-transpeptidase, estimated diseaseduration, degree of necro-inflammatory activity, and HCV genotype. Upon comparingpatients that did not present a sustained response (n=26) with patients that didpresent a sustained response (n=7), we observed that the only predictor of sustainedresponse with statistical significance was the type of treatment employed (P<0.002).CONCLUSIONS: Ambulatory patients with compensated cirrhosis caused by theHCV, when submitted to the interferon and ribavirin treatment for 1 year, presenteda statistically significant higher rate of sustained response than patients submittedto the interferon only treatment for the same period of time. There was no statisticallysignificant difference between the groups in terms of frequency of side-effects.OBJETIVO: Este trabalho teve por objetivo avaliar a taxa de resposta completa aofinal do tratamento e de resposta sustentada em pacientes com cirrose pelo vírusda hepatite C tratados com interferon isolado ou combinado com ribavirina.PACIENTES E MÉTODOS: Um total de 33 pacientes cirróticos ambulatoriais, VHCpositivos, sem outras causas identificáveis de doença hepática, compensados eclassificados como Child-Pugh A, foram divididos em dois grupos, de forma nãorandomizada: Grupo 1 (n=13), tratado com interferon 3 MU, subcutâneo, três vezespor semana, por 12 meses; Grupo 2 (n=20), tratado com interferon na mesmaposologia anterior, associado a ribavirina, 1000 mg/dia, via oral, em duas tomadas,diariamente, por 12 meses.RESULTADOS: Dos 33 pacientes, 24 (73%) eram homens e a idade variou entre35 e 72 anos (média de 50,7 ± 9 anos). A taxa de resposta completa ao final dotratamento e de resposta sustentada foi, respectivamente, de 1/13 (8%) e 0/13(0%) no Grupo 1 versus 11/20 (55%) e 7/20 (35%) no Grupo 2 (P<0,005). Ambos osgrupos eram semelhantes quanto a idade, sexo, ferritina sérica, gamaglutamiltranspeptidase, tempo estimado de doença, grau de atividade necro-inflamatória egenótipo do VHC. Comparando-se os pacientes não-respondedores (n=26) comaqueles que obtiveram resposta sustentada (n=7), observou-se que o único fatorpreditivo de resposta estatisticamente significativo foi o tipo de tratamento utilizado(P<0,002).CONCLUSÕES: Pacientes ambulatoriais com cirrose compensada causada peloVHC apresentam taxa de resposta sustentada significativamente superior quandotratados com 1 ano de interferon combinado com ribavirina, em comparação cominterferon isolado pelo mesmo período. Não houve diferença estatística na freqüênciade efeitos adversos entre os grupos

ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA NEURAMINIDASE DOS VÍRUS INFLUENZA A H1N1PDM09 CIRCULANTES NO RIO GRANDE DO SUL ENTRE 2009 E 2012

A gripe é uma doença infecciosa epidêmica aguda causada pelo vírus da influenza e que ocorre em aves e mamíferos, incluindo o homem. A mais recente pandemia de gripe humana foi causada pelo vírus influenza A H1N1pdm09 com mais de 30.000 casos confirmados no Brasil. No Rio Grande do Sul (RS), 3.585 casos foram positivos em 2009 (298 óbitos), 108 em 2011(13 óbitos) e 517 em 2012 (66 óbitos). A evolução dos vírus influenza ocorre devido a mutações no genoma com consequentes variações antigênicas das sequências das proteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). O objetivo deste estudo foi analisar a diversidade das sequências de aminoácidos da NA dos vírus influenza A H1N1pdm09 que circularam no RS entre os anos de 2009 a 2012, bem como verificar a ocorrência de casos de resistência aos inibidores de NA. Foram selecionadas 365 amostras clínicas de pacientes com Síndrome Respiratória Aguda Grave (SRAG) e com diagnóstico confirmado de infecção pelo vírus A H1N1pdm09, entre os anos de 2009 e 2012 (sendo 140 do ano de 2009, 105 de 2011 e 120 de 2012). Estas amostras foram submetidas à extração do RNA pelo método de adsorção em sílica e após amplificação pelas técnicas de RT-PCR e Nested PCR. Os produtos de amplificação foram submetidos ao sequenciamento de nucleotídeos e as sequências de aminoácidos da NA foram deduzidas e analisadas comparativamente. Os resultados mostraram elevado grau de identidade entre todas as amostras analisadas (97,1% e 100%), sendo observadas apenas alterações pontuais de aminoácidos em relação à cepa original (e vacinal) A/Califórnia/07/2009. Foram observados oito diferentes padrões de sequências em 2009, 21 em 2011 e 25 em 2012. Adicionalmente foram observadas alterações pontuais características na grande maioria das amostras circulantes no RS, como I241V em todas as amostras do ano 2009 (mas raramente em 2011 e 2012) e V106I em praticamente todas as amostras dos três anos. Outras alterações pontuais importantes foram V81A (n=16), S95N (n=39), T157A (n=30) e I193V (n=39) em 2011, I188T (n=22) e C285S (n=70) em 2012. A análise das modificações que conferem resistência aos inibidores da NA demonstrou a ocorrência de três amostras com a alteração H275Y (resistência comprovada ao oseltamivir) e uma com a substituição S247N (provável resistência ao oseltamivir)

DIVERSIDADE GENÉTICA DE MYCOPLASMA SYNOVIAE NO BRASIL

Mycoplasma synoviae (MS) é um agente infeccioso que acomete galinhas e perus, podendo causar doença respiratória crônicae sinovite infecciosa com graus variados de manifestações clínicas. Esta espécie possui diferentes cepas que podem ser caracterizadaspor técnicas de análise genética. O objetivo deste estudo foi analisar a diversidade de um gene específico (vlhA) em amostras de MSde granjas de produção de aves de diferentes locais do Brasil. Amostras de traquéias foram obtidas de aves de 35 lotes de granjaspositivas para MS de diferentes estados do país. DNA total destas amostras foi extraído pela metodologia de sílica e após foi realizadadupla amplificação de uma região variável (284 a 341 pares de bases - pb) da extremidade 5´ do gene vlhA pela técnica dareação em cadeia da polimerase (nested-PCR). As amostras positivas foram sequenciadas e analisadas comparativamente para aconstrução da árvore filogenética e avaliação do tamanho de uma região interna específica (PRR). Os resultados demonstraram aocorrência de 16 diferentes sequências de aminoácidos nas 35 amostras avaliadas e a análise filogenética mostrou a ocorrência de 8diferentes clados. A sequência de aminoácidos da respectiva cadeia polipeptídica também apresentou diversidade entre as amostras.A região variável PRR foi a que apresentou maior polimorfismo e as amostras foram classificadas em 5 tipos previamente caracterizados(A, C, D, E e F) e um novo tipo (G) encontrado em amostras de granjas do estado do Rio Grande do Sul. Estes resultadosdemonstraram que as amostras de MS de granjas de produção avícola do Brasil apresentam diversidade no gene vlhA

Identification of enteric viruses circulating in a dog population with low vaccine coverage

Although the use of vaccines has controlled enteric diseases in dogs in many developedcountries, vaccine coverage is still under optimal situation in Brazil. There is a large popula-tion of nonimmunized dogs and few studies about the identification of the viruses associated with diarrhea. To address this situation, stool samples from 325 dogs were analyzed bypolymerase chain reaction for the detection of common enteric viruses such as Canine ade-novirus (CAdV), Canine coronavirus (CCoV), Canine distemper virus (CDV), Canine rotavirus (CRV)and Carnivorous protoparvovirus 1 (canine parvovirus 2; CPV-2). At least one of these specieswas detected in 56.6% (184/325) of the samples. The viruses detected most frequently ineither diarrheic or nondiarrheic dog feces were CPV-2 (54.3% of the positive samples), CDV(45.1%) and CCoV (30.4%), followed by CRV (8.2%) and CAdV (4.9%). Only one agent wasdetected in the majority of the positive samples (63%), but co-infections were present in 37%of the positive samples and mainly included CDV and CPV-2. The data presented herein canimprove the clinical knowledge in regions with low vaccine coverage and highlight the needto improve the methods used to control these infectious diseases in domestic dogs

DIFERENCIAÇÃO MOLECULAR DE Mycoplasma gallisepticum (MG)

Este trabalho teve como objetivo diferenciar cepas de Mycoplasma gallisepticum isolados deperus, galinhas e pássaros ornamentais através da comparação entre seqüências de genes de antígenosde superfície. Analisou-se 10 cepas de referência, 6 isolados de galinhas, 9 isolados de perus e 5isolados de pássaros ornamentais. Foram escolhidos 3 genes relacionados com antígenos de superfície(citoadesina - MGC1, lipoproteína – LP e a proteína de fase variável - Pvpa) que foram amplificadospela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e posteriormente seqüênciados. A análise dos 3genes permitiu diferenciar todas cepas de referência além de estabelecer um estudo filogenético comos distintos isolados. Os isolados de pássaros ornamentais apresentaram alto grau de identidade nasseqüências analisadas e distinção dos MG isolados de perus e galinhas. Foram encontrados 5 isoladosde perus e 2 de galinhas que apresentaram, respectivamente, seqüências idênticas às cepas vacinais.Há evidências de que estes isolados possam estar relacionados com cepas vacinais, de uso freqüente na avicultura comercial. Os demais isolados não apresentaram identidade entre si ou mesmo com ascepas de referência formando os demais padrões descritos.Palavras chave: Mycoplasma gallisepticum, diferenciação molecular, PCR

Avaliação de sensibilidade de três sistemas para a detecção de Mycoplasma gallisepticum pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Foram analisados neste trabalho três sistemas para detecção molecular de Mycoplasma gallisepticum(MG) pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Dois sistemas são baseados em amplificações únicas(genes de proteínas de superfície GapA e mgc2) e um sistema no formato nested-PCR (gene GapA). Asensibilidade analítica foi avaliada pela detecção de diluições seriadas de cepa vacinal e pela análise de 44amostras clínicas provenientes de swabs de galinhas e perus. A nested-PCR apresentou maior sensibilidadeaos sistemas de amplificação única tanto na diluição de vacina quanto nas amostras clínicas.Palavras-chave: Mycoplasma gallisepticum, sensibilidade, PCR

Caracterização de fatores de virulência presentes em isolados de Escherichia coli provenientes da região Sul do Brasil

Foram analisados neste trabalho 42 isolados de Escherichia coli originários de 15 granjas de suínos da regiãoSul do Brasil. Os isolados foram obtidos a partir de fezes de suínos com suspeita de colibacilose. As amostras foramcaracterizadas quanto a presença de fatores de virulência (FVs) pela reação em cadeia da polimerase (PCR), queconsistiu na detecção das fímbrias F4, F5, F6, F18 e F41 e das toxinas Stb, StaP, Stx2e e LT. Dos 42 isolados,somente 15 foram confirmados como portadores dos FVs estudados, sendo que as toxinas mais freqüentementeencontradas foram Stb seguida da StaP. Nos isolados portadores de toxinas foram encontradas as fímbrias F18, F4 e F5, e 4 isolados toxigênicos não apresentaram as fímbrias analisadas. A utilização da PCR para detecção detoxinas e fímbrias demonstrou ser um teste prático no diagnóstico da colibacilose.Palavras-chave: Escherichia coli, ETEC, PCR, colibacilose, fatores de virulência