Study and clinical evaluation of new molecular markers in breast cancer

Recent reports have included PALB2 (Partner and localizer of BRCA2) in the growinglist of hereditary cancer genes. PALB2 is located in the chromosome region 16p12.1and consists of 13 exons transcribing approximately 3.5Kb mRNA, which encodes aprotein of 1186 amino acids. Exons 4 and 5 are much larger than all the others (65%of the coding area). Its deleterious mutations confer a moderate breast cancer risk inheterozygotes and Fanconi anemia in biallelic mutation carriers (hence its other name:FANCN) and are rare: 1-2 % of BRCA negative breast cancer patients in mostpopulations. PALB2 protein co-localizes with BRCA2 and BRCA1 in nuclearstructures and enables error-free homologous recombination DNA repair of doublestrandedbreaks. This important contribution could be severely diminished, not onlyby mutations, but also by epigenetic mechanisms such as promoter CpG islandmethylation. In such a case, patients could benefit from therapeutic treatment withPARP inhibitors.The aim of the study was: A) The genetic analysis of the PALB2 gene foridentification of mutations in DNA from peripheral blood samples of patients withfamiliar breast and ovarian cancer B) the expression analysis of PALB2 gene in tissuesamples of patients with sporadic breast cancer for identification of epigeneticsmechanisms that might silence gene’s expression.MethodsFor the genetic analysis of the two large exons of the gene (exon 4 and 5), a PTTnovel methodology was developed (Protein Truncation Test) and for the rest smallexons of the gene the HRMA methodology was applied. The results were confirmed with DNA Sequencing. In addition the gene was also tested for large rearrangementswith MLPA analysis.For the expression analysis of PALB2 gene, pyrosequencing methodology forstudying the DNA methylation of the gene’s promoter and RT- qPCR with a TaqManprobe in the Light Cycler for the quantification of PALB2 mRNA transcripts weredeveloped and validated. Then, there was an effort to confirm the expression resultswith immunohistochemistry (IHC) with a polyclonal PALB2 antibody During genetic analysis of 57 samples (among them 15 samples of medullary breastcancer) the missence mutations Q599R was found in two samples, the synonymousmutation T1100T was found in five samples and an intronic new polymorphism inone sample. The MLPA analysis was negative in all samples. No deleterious PALB2mutation was detected. This was the first study investigating PALB2 mutations in therare medullary breast cancer.During the DNA methylation analysis of the PALB2 promoter all specimens werefound to be negative therefore, rendering DNA methylation as an unlike mechanismfor its expression silencing. In RT-qPCR four samples had no PALB2 expression. Thefact that PALB2 gene was not expressed in four specimens was examined further withimmunohistochemistry experiments. They have shown only cytoplasmic staining ofthe PALB2 protein with no nuclear staining; probably due to defective antibody, thusit was not possible to draw any conclusion for PALB2 protein expression profile ofthose four samples. The average value of the copies was 7,23×104 copies/μg of totalRNA, while the median value was 1,34×104 copies/μg (range 3,51×10 to 1,23×106copies/μg). The results were compared with clinical and histopathological data (tumorsize, grade, lymph node involvement, hormone receptors, C-ERBB2 overexpression)but no significant statistical correlation was found. So far, PALB2 expression does notseem be a promising prognostic and predictive biomarker for sporadic breast cancer.Πρόσφατες μελέτες συμπεριλαμβάνουν το γονίδιο PALB2 (Partner and localizer ofBRCA2) στην συνεχώς αυξανόμενη λίστα των γονιδίων κληρονομούμενου καρκίνου του μαστού. Εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 16p12.1 και αποτελείται από 13 εξόνια που μεταγράφουν mRNA περίπου 3,5 Kb που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 1186 αμινοξέων. Τα εξόνια 4 και 5 είναι αισθητά μεγαλύτερα από όλα τα άλλα (65 % του γονιδίου). Οι παθογνωμικές μεταλλάξεις του προσδίδουν έναν σοβαρό κίνδυνο καρκίνου του μαστού στους ετεροζυγώτες και αναιμία Fanconi στους φορείς διαλληλικών μεταλλάξεων (γι’ αυτό αλλιώς ονομάζεται και FANCN). Οι μεταλλάξεις του είναι σπάνιες και έχουν ανιχνευθεί στο 1-2 % των BRCA αρνητικών γυναικών με καρκίνο του μαστού. Η πρωτεΐνη PALB2 αποτελεί τον συνδετικό κρίκο των BRCA2 και BRCA1 που εντοπίζονται στον πυρήνα και συμμετέχει στην επιδιόρθωση των σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA μέσω του αλάθητου ομόλογου ανασυνδυασμού. Η σημαντική του συνεισφορά θα μπορούσε να περιοριστεί αρκετά,εκτός από την ύπαρξη μεταλλάξεων, εάν επηρεαζόταν από επιγενετικούς μηχανισμούς όπως την μεθυλίωση των CpG νησίδων του υποκινητή. Σ’ αυτή την περίπτωση, οι ασθενείς θα μπορούσαν να ωφεληθούν από θεραπευτική αγωγή μεPARP αναστολείς.Σκοπός της εργασίας ήταν: Α) η πλήρη γενετική μελέτη του γονιδίου PALB2 για την εύρεση τυχόν μεταλλάξεων σε δείγματα DNA περιφερικού αίματος ασθενών με κληρονομούμενο καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών Β) η ανάλυση έκφρασης του γονιδίου PALB2 σε δείγματα ιστού ασθενών με σποραδικό καρκίνο του μαστού για τον εντοπισμό τυχόν επιγενετικών μηχανισμών που να εμποδίζουν την έκφρασή του. Μέθοδοι. Για τη γενετική ανάλυση των μεγάλων εξονίων του γονιδίου (εξόνιο 4 και 5)αναπτύχθηκε νέα μεθοδολογία PTT (Protein Truncation Test) ενώ για τα υπόλοιπα μικρά εξόνια του γονιδίου εφαρμόστηκε μεθοδολογία HRMA. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σ’ όλα τα δείγματα με την μεθοδολογία DNA Sequencing που είχε αναπτυχθεί από την ομάδα μας. Επιπλέον, το γονίδιο ελέγχθηκε και για μεγάλες γενωμικές αναδιατάξεις με την μέθοδο MLPA. Για την ανάλυση έκφρασης του γονιδίου PALB2, αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν μεθοδολογίες pyrosequencing για την μελέτη μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου και RT-qPCR με ανιχνευτή TaqMan στο Light Cycler για την ποσοτικοποίηση τωνPALB2 mRNA μεταγράφων. Απομονώθηκε RNA από 91 καρκινικά δείγματα (και 4 φυσιολογικά) και παράχθηκε cDNA. Στην συνέχεια έγινε προσπάθεια επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων έκφρασης με PALB2 πολυκλωνικό αντίσωμα με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας (IHC).Αποτελέσματα – Συμπεράσματα γενετικής ανάλυσης PALB2 γονιδίου. Κατά τη γενετική ανάλυση 57 δειγμάτων (ανάμεσά τους 15 με μυελοειδή καρκίνο του μαστού) βρέθηκε σε δύο δείγματα η παρανοηματική μετάλλαξη Q599R, σε πέντε η συνώνυμη μετάλλαξη Τ1100Τ και σε ένα μια νέα ιντρονική μετάλλαξη. Όλες θεωρούνται πολυμορφισμοί και δεν ανιχνεύθηκε παθογνωμική μετάλλαξη. Η MLPAανάλυση απέβηκε αρνητική σ’ όλα τα δείγματα. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη καταγεγραμμένη PALB2 γενετική ανάλυση στον σπάνιο υπότυπο των μυελοειδών καρκινωμάτων μαστού.Αποτελέσματα – συμπεράσματα έκφρασης PALB2 γονιδίου. Κατά τη μελέτη μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου δε βρέθηκε κανένα δείγμα που να είναι μεθυλιωμένο, συνεπώς η μεθυλίωση του DNA δεν φαίνεται να είναι ένας πιθανός μηχανισμός αποσιώπησης του γονιδίου. Κατά την ανάλυση έκφρασης με RTqPCR,4 δείγματα από τα 91 δεν εμφάνισαν έκφραση. Το γεγονός αυτό διερευνήθηκε περαιτέρω με πειράματα ανοσοϊστοχημείας. Κατέδειξαν μόνο κυτταροπλασματική χρώση της PALB2 πρωτεΐνης και καθόλου πυρηνική όπως αναμενόταν γεγονός που πιθανόν οφείλεται σε ελαττωματικό αντίσωμα και συνεπώς δεν μπορούσε να εξαχθεί συμπέρασμα για τον λόγο μη έκφρασης του γονιδίου. O μέσος όρος των αντιγράφων ήταν 7,23×104copies/μg ολικού RNA, ενώ η μέση τιμή ήταν 1,34×104copies/μg(εύρος 3,51×10 to 1,23×106copies/μg). Έγινε προσπάθεια συσχέτισης των επιπέδωνPALB2 mRNA με τα κλινικά και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων που αναλύθηκαν (μέγεθος όγκου, βαθμός, λεμφαδένες, μετάσταση, ορμονικούς υποδοχείς, C-ERBB2 έκφραση) ωστόσο δεν βρέθηκε κάποιος στατιστικά σημαντικός συσχετισμός. Δεν φαίνεται λοιπόν να αποτελεί η PALB2 έκφραση καλό προγνωστικό και προβλεπτικό δείκτη

Hereditary breast cancer: beyond BRCA genetic analysis; PALB2 emerges

Despite the initial enthusiasm following the discovery of the association of BRCA germline mutations with hereditary breast and/or ovarian cancer, in many families affected by the syndrome no pathogenic mutations were detected in the two genes, although exhaustively searched. Many other genes have also been implicated due to their role in the same pathway of DNA repair where the BRCA1/2 genes are involved: homologous recombination (HR). Among them, PALB2 clearly emerges as the third breast cancer susceptibility gene. Its mutations have been detected in most populations investigated so far, albeit rarely: in 1%-4% of families negative for BRCA mutations, with either partial or complete penetrance. In some populations, PALB2 recurrent mutations have been identified and the estimated hazard risks are comparable to those of BRCA mutations. Since new effective targeted therapeutic options are becoming available (”synthetic lethality” with novel PARP inhibitors, etc.) that are applicable to all those patients with a defect in HR pathway, it is imperative to detect all these candidate patients. Data obtained from laboratory tests in the tumor (simple immunohistochemistry, gene expression analysis, etc.) can assist in the recognition of a specific pattern (BRCA1ness, HRless) so that even patients that look “sporadic” could benefit from these targeted therapies. Therefore, a genetic analysis algorithm is proposed, although with the advent of Next Generation Sequencing it is predicted that in the future most germline genetic alterations and also somatic or epigenetic events in the tumor of these genes will be detected

Development of novel real-time PCR methodology for quantification of COL11A1 mRNA variants and evaluation in breast cancer tissue specimens

Background: Collagen XI is a key structural component of the extracellular matrix and consists of three alpha chains. One of these chains, the alpha 1 (XI), is encoded by the COL11A1 gene and is transcribed to four different variants at least (A, B, C and E) that differ in the propensity to N-terminal domain proteolysis and potentially in the way the extracellular matrix is arranged. This could affect the ability of tumor cells to invade the remodeled stroma and metastasize. No study in the literature has so far investigated the expression of these four variants in breast cancer nor does a method for their accurate quantitative detection exist. Methods: We developed a conventional PCR for the general detection of the general COL11A1 transcript and real-time qPCR methodologies with dual hybridization probes in the LightCycler platform for the quantitative determination of the variants. Data from 90 breast cancer tissues with known histopathological features were collected. Results: The general COL11A1 transcript was detected in all samples. The developed methodologies for each variant were rapid as well as reproducible, sensitive and specific. Variant A was detected in 30 samples (33 %) and variant E in 62 samples (69 %). Variants B and C were not detected at all. A statistically significant correlation was observed between the presence of variant E and lymph nodes involvement (p = 0.037) and metastasis (p = 0.041). Conclusions: With the newly developed tools, the possibility of inclusion of COL11A1 variants as prognostic biomarkers in emerging multiparameter technologies examining tissue RNA expression should be further explored

TLR-4 and CD14 Genotypes and Soluble CD14: Could They Predispose to Coronary Atherosclerosis?

Background: Inflammatory mechanisms are key to the pathogenesis of atherosclerosis. Functional polymorphisms of TLR-4, Asp299Gly and Thr399Ile, CD14 promoter area C260T polymorphism and plasma levels of soluble CD14 are studied in subjects with Coronary Artery Disease (CAD). Methods: DNA was obtained from 100 human paraffin-embedded aortic specimens, from cadavers with known coronary atheromatosis (Group A) and 100 blood samples from patients with CAD, as detected by cardiac Multi-Detector-row-Computed-Tomography (MDCT) (Group B). Our control group consisted of 100 healthy individuals (Group C). Genotyping was performed by Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction (RFLP-PCR). Plasma levels of sCD14 were measured with ELISA. Results: For TLR-4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms, no statistically significant differences were observed. Regarding the C260T polymorphism, frequencies of T allele were significantly higher in the control group compared to the case group (p = 0.05). The Odds Ratio (OR) showed statistically significant association of TT genotype with healthy individuals (OR 0.25, 95% Confidence Interval CI 0.10–0.62, p = 0.0017). Plasma levels of sCD14 in patients with CAD (mean value = 1.35 μg/mL) were reduced when compared to reference value. Conclusions: The studied polymorphisms ofTLR-4 showed no association with CAD. Conversely, the functional polymorphism of CD14 has a statistically significant difference in expression between healthy and affected by CAD individuals

La Petite presse : journal quotidien... / [rédacteur en chef : Balathier Bragelonne]

22 décembre 18761876/12/22 (A10,N3881)