Distribution, regulation and physiological roles of catechol-O-methyltransferase (COMT) in rodents

Catechol-O-methyltransferase (COMT) metabolises catecholamines such as dopamine, noradrenaline and adrenaline, which are well-characterised neurotransmitters that play important roles in the regulation of physiological processes. The COMT enzyme exists in membrane-bound (MB-COMT) and soluble (S-COMT) forms that are both encoded by the same gene. Presently, the necessity and physiological importance of the existence of two COMT isoenzymes remains partially unknown. The aim of this thesis was to provide new insights into the specific distribution patterns of MB-COMT and S-COMT, to verify the proposed hormonal regulation of COMT and to investigate its possible physiological role in feeding behaviour. We used two different study designs to address the distribution of COMT in the brain. First, we utilised dopaminergic and noradrenergic toxins to assess the presence of COMT in presynaptic neurons originating from selected brain areas. Successful lesioning of the neurons was confirmed by measuring dopamine and noradrenaline levels in their respective projection areas. However, despite successful lesioning, no changes in COMT protein expression or activity could be noted, indicating that COMT is not present in presynaptic dopaminergic and noradrenergic neurons. The specific distribution patterns of MB-COMT and S-COMT were studied in an S-COMT-deficient mouse line (lacking the S-COMT form of COMT). By comparing these mice to wild type mice, we found that the general distribution patterns of both COMT isoforms were similar between the genotypes. Notably, S-COMT-deficient mice did not exhibit nuclear COMT staining, indicating that MB-COMT is not present in cell nuclei. Furthermore, S-COMT-deficient mice allowed us to examine the association of MB-COMT with the plasma membrane. Contrary to previous assumptions, MB-COMT is not associated with the plasma membrane, but instead may be attached to intracellular cytosolic membranes. The proposed regulatory function of oestrogens on COMT activity was studied by subjecting male and female Wistar rats to different hormonal treatments over a two-week period. Antagonising/modulating the effects of oestrogen via the administration of tamoxifen increased COMT activity and expression. Unexpectedly, increasing oestradiol levels in male rats also led to the upregulation of COMT expression in several tissues, underscoring the importance of COMT in the clearance of biologically active oestrogen metabolites. Finally, we used female rodents (rats and mice) to address the possible role of COMT in feeding behaviour. Our studies revealed that acute COMT inhibition affects the feeding pattern of rodents; COMT-inhibited animals have significantly more ''long'' meals (lasting 300 sec or more) than vehicle-treated animals. Notably, a relatively short starvation period of 16 h induced a slight, albeit not significant, decrease in prefrontal and striatal COMT activity in mice. This finding is interesting, especially as COMT activity is thought to be rather robust, and may suggest the increased importance of COMT during altered physiological status. In conclusion, although the specific roles of MB-COMT and S-COMT remain partly obscure, their absence from presynaptic dopaminergic and noradrenergic neuron terminals suggests a secondary (and perhaps more modulatory) role of COMT in neurotransmitter metabolism in the brain. Furthermore, the observed decrease in COMT activity after a relatively short starvation period suggests that COMT has an increased importance during certain physiological states. Finally, the observed regulatory function of oestrogens on COMT activity and protein expression in vivo may be of clinical importance as COMT inhibitors are used as adjuncts in the treatment of PD.Katekoli-O-metyylitransferaasi (COMT) hajottaa katekoliamiineja, kuten dopamiinia, noradrenaliinia ja adrenaliinia, jotka toimivat välittäjäaineina useiden fysiologisten toimintojen säätelyssä. Entsyymiä esiintyy kahta muotoa, kalvoihin sitoutuvaa (MB-COMT) ja liukoista (S-COMT), jotka ovat saman geenin tuotteita. Näiden kahden erillisen isoentsyymin fysiologista merkitystä ja tarpeellisuutta ei vielä tunneta tarkasti. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin COMT:n esiintymistä jyrsijöiden aivoissa kahdessa koeasetelmassa. Rottien aivojen dopamiini- ja noradrenaliinihermosolut tuhottiin selektiivisin hermomyrkyin, jotta COMT:n sijaintia näiden hermosolujen päätteissä tietyillä aivoalueilla voitiin arvioida. Vaikka hermosoluvauriot tuotettiin menestyksellisesti, COMT-proteiinin määrässä tai sen toiminnassa ei nähty muutoksia. Havainnosta pääteltiin, että kyseistä entsyymiä ei ilmeisesti esiinny dopamiini- ja noradrenaliinihermosolujen päätteissä. COMT-isoentsyymien esiintymistä aivoissa tutkittiin lisäksi hyödyntämällä S-COMT -puutteellista hiirikantaa. Verrattaessa näitä hiiriä saman kannan villityypin hiiriin havaittiin COMT-isoentsyymien jakaumien olevan samankaltaiset molemmissa genotyypeissä. S-COMT -puutteellisilta hiiriltä ei kuitenkaan löydetty COMT:a tumista lainkaan, mikä kertoo pelkän liukoisen muodon ilmenevän solujen tumissa. S-COMT -puutteellisia hiiriä hyödynnettiin myös tutkimuksessa, jossa selvitettiin MB-COMT:n liittymistä solukalvoon. Vastoin aiempia oletuksia liittymistä ei kuitenkaan havaittu, vaan ilmeisesti kyseinen muoto sijaitsee solunsisäisten solulimakalvostojen yhteydessä. Väitöstyössä selvitettiin myös estrogeenien kykyä säädellä COMT:n toimintaa altistamalla Wistar rottanaaraita ja -koiraita kahden viikon ajan erilaisille hormonaalisille käsittelyille. Estrogeenin vaikutusten estäminen tai muunteleminen tamoksifeenilla lisäsi COMT:n aktiivisuutta ja ilmentymistä naarasrotilla. Vastoin odotuksia myös estrogeenin annostelu koirasrotille lisäsi COMT:n ilmentymistä useissa kudoksissa, mikä painottaa COMT:n tärkeää tehtävää estrogeenin biologisesti aktiivisten hajoamistuotteiden poistamisessa. Lisäksi väitöstyössä tutkittiin COMT:n mahdollista osuutta syömiskäyttäytymisessä naarashiirillä ja rotilla. Tutkimuksessa selvisi, että COMT:n toiminnan lyhytkestoinen esto vaikutti jyrsijöiden tapaan syödä: COMT-estäjää saaneiden eläinten havaittiin ruokailevan pitkään (aterian kesto yli 300 s) useammin kuin verrokkiryhmän eläinten. Lisäksi suhteellisen lyhyt 16 tunnin paastottaminen aiheutti lievän COMT-aktiivisuuden laskun hiirten aivojuoviossa ja etuaivokuorella, joskaan tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Tämä mielenkiintoinen havainto viittaa kuitenkin siihen, että COMT:n merkitys saattaa korostua fysiologisen tilan muutoksissa, vaikka COMT:n aktiivisuuden on aiemmin ajateltu olevan hyvin vakaa. Yhteenvetona tutkimuksista voidaan todeta, että MB-COMT:n ja S-COMT:n samankaltainen jakauma sekä puuttuminen dopaminergisista ja noradrenergisista hermopäätteistä antavat ymmärtää, että COMT:lla on toissijainen (tai muunteleva) rooli hermovälittäjäaineiden aineenvaihdunnassa aivoissa. Havainnoilla estrogeenien vaikutuksesta COMT:n toiminnan säätelyyn sekä sen ilmentymisen kompensatoriseen lisääntymiseen saattaa olla kliinistä merkitystä, sillä COMT-estäjiä käytetään Parkinsonin taudin lääkkeinä. Lisäksi jo suhteellisen lyhyen paaston aiheuttama COMT-aktiivisuuden lasku antaa vihjeitä entsyymin mahdollisesta piilevästä tehtävästä fysiologisissa muutostiloissa. Vaikka COMT:n toiminnan esto ei muuta katekoliamiinien pitoisuuksia perustilanteessa, COMT:n merkitys saattaa kasvaa tietyissä fysiologisissa ja patologisissa tiloissa

Catechol-O-methyltransferase (COMT) protein expression and activity after dopaminergic and noradrenergic lesions of the rat brain

Peer reviewe

Details of primary antibodies.

<p>Details of primary antibodies.</p

Successful dopaminergic lesions do not cause changes in the COMT protein levels.

<p>A normalized optical density (OD) analysis of (A) tyrosine hydroxylase (TH) or (B) COMT positive neurons in the substantia nigra (SN) and striatum (Stri) after a unilateral 6-OHDA (8 µg) lesion of the SN, and TH and COMT positive neurons in the prefrontal cortex (PFC) after 6-OHDA lesion of the VTA. At least 3 separate stainings were done, and mean ± SEM are shown. Significant decrease in TH OD was seen in all areas analyzed but none in COMT OD. ***, P<0.001; **, P<0.01 vs. control side (Student t-test).</p

A–T. COMT protein is colocalized with a GABAergic (glutamate decarboxylase, GAD65/67; green) but less or none with a cholinergic marker (choline acetyltransferase, ChAT; green).

<p>In the striatum (Stri), COMT (red) was found to be colocalized with GABAergic neurons and fibres (A–D; white arrows and yellow color depicting colocalization), while no colocalization with cholinergic nerves was seen (E–H). Moreover, COMT was not colocalized with cholinergic neurons in the medial septum (MS; I–L). In the cortex, COMT was also colocalized with GABAergic interneurons (M–P; white arrows, yellow color) and a weak colocalization with some cholinergic nerves was seen (Q–T). Nuclei are visualized by DAPI (blue color). Scale bars are 10 µm in all pictures. Three separate stainings were done and representative examples are shown.</p

Illustration of the injection sites in dopaminergic lesions in the rat brain.

<p>(A) Anatomical locations of the two injection sites in the Paxinos Rat Atlas (circles). (B) Actual tissue slice demonstrating the positions of the two injection sites (blue colour). (C) Illustration of the main projection areas of the ventral tegmental area (VTA) and lateral substantia nigra (SN). (D) Projection areas of the locus coeruleus.</p

Dopamine levels after 6-OHDA-lesions and noradrenaline levels after DSP-4 lesions.

<p>The results (mean±sem) are expressed as absolute values (ng/mg) and as percentage (in parenthesis) of the intact side (6-OHDA) and control animals (DSP-4) set as 100. Significant differences from intact or controls values:</p>*<p>p<0.05;</p>**<p>p<0.01;</p>***<p>p<0.001. Key: PFC, prefrontal cortex; NAcc, nucleus accumbens; SN, substantia nigra; VTA, ventral tegmental area.</p

A–X. COMT protein neither colocalized with tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons nor decreased after destruction of dopamine neurons.

<p>The effect of dopaminergic lesion on the COMT immunoreactivity. The 6-OHDA lesion of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) were made as described and COMT immunoreactivity analysed in the projection areas. In the intact SN, COMT (red color) was not colocalized with dopaminergic neurons (tyrosine hydroxylase, TH; green color; A–D), and lesion in the SN did not affect COMT immunoreactivity (E–H) although TH-immunoreactivity disappeared (E). The situation was similar in the striatum (Stri; I–L versus M–P). Moreover, in the intact prefrontal cortex (PFC), the projection area of the VTA, COMT did not colocalize with dopaminergic nerves (Q–T). Moreover, the lesion in the VTA did not effect on COMT on the PFC (U–W). Nuclei are visualized by DAPI (blue color). Scale bars are 10 µm in all pictures. Three separate stainings were made and representative examples are shown. Quantification of ODs was done in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0061392#pone-0061392-g002" target="_blank">Fig.2</a>.</p