Efeitos do veneno de Loxosceles similis no modelo de implante subcutâneo de esponja em camundongos Swiss

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-12T06:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 n_bia_braga_pereira_tese_final.pdf: 4759948 bytes, checksum: ac23c0d75b6093d3dc281da343afbcd5 (MD5) Previous issue date: 17O envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles provoca um conjunto de sinais e sintomas, chamado de loxoscelismo, que na maioria dos casos manifesta-se através do quadro dermonecrótico. O modelo mais utilizado para o estudo do loxoscelismo cutâneo é o coelho. No entanto, o desenvolvimento de um modelo animal de menor porte, fácil manuseio, menor custo e manutenção são necessários para o estudo da patogênese do loxoscelismo. A inflamação provocada pelo veneno bruto de Loxosceles similis, foi avaliada considerando a ativação de neutrófilos e macrófagos, vasodilatação, hiperemia, edema, hemorragia e a produção do TNF e VEGF utilizando o modelo murino de implante de esponjas. Trinta e dois camundongos Swiss, machos (6-8 semanas) foram implantados subcutaneamente com discos de esponjas de poliéster-poliuretano. Quatorze dias após a implantação os animais foram separados em dois grupos: (1) grupo controle: 16 camundongos que receberam intraimplante 30 L de solução salina; (2) grupo tratado: 16 camundongos que receberam a injeção intra-implante de 30 L (0.5 g) do veneno bruto de L. similis. Os animais foram eutanaziados com xilazina/quetamina 1h e 4h pós-injeção intra-implante. Microscopicamente, os implantes dos grupos tratados apresentaram inflamação aguda caracterizada por: infiltrado neutrofílico, edema, vasodilatação, hiperemia e hemorragia intensa. Alguns vasos apresentaram-se com as suas paredes rompidas. Através da análise morfométrica foi possível observar que a área de vasos foi significativamente maior nos grupos tratados. Os parâmetros bioquímicos como: conteúdo de hemoglobina, níveis das citocinas fator de necrose tumoral (TNF), fator de crescimento endotelial (VEGF), atividade das enzimas n-acetil- - glucosaminidase (NAG) e mieloperoxidase (MPO) foram significativamente maiores nos grupos tratados. Os efeitos do veneno de Loxosceles no tecido de granulação do implante em camundongos foram similares ao que se observa no loxoscelismo cutâneo em outras espécies (humanos ou coelhos). Consequentemente, o modelo murino de implante de esponjas promove um novo método para investigação de mecanismos celulares e moleculares associados com o loxoscelismo cutâneo.O envenenamento por aranhas Loxosceles conduz a um conjunto de sinais e sintomas, denominado loxoscelismo, que na maioria dos casos se manifesta sob o quadro dermonecrótico. Neste estudo, utilizou-se o modelo de implante subcutâneo de esponja em camundongo para descrever os efeitos do veneno de Loxosceles similis, com ênfase em 24 h após a injeção intraimplante e para avaliar a patogenia do loxoscelismo 1, 4 e 24 horas após a injeção do veneno. O presente trabalho tem como objetivos: (1) caracterizar histologicamente os efeitos do veneno bruto de L. similis no implante subcutâneo de esponjas; (2) quantificar os mastócitos do implante e mensurar sua atividade de desgranulação; (3) quantificar os subtipos de colágeno tipo I e III; (4) verificar, quantificar e avaliar a importância da apoptose no implante 1, 4 e 24 horas após a injeção do veneno na patogenia do loxoscelismo. Trinta camundongos Swiss (6-8 semanas, machos) foram implantados subcutaneamente com esponjas de poliéster-poliuretano. Após o 14º dia de implante, os animais foram divididos em seis grupos (n=5 para cada grupo): três grupos controles (C1h, C4h e C24 h), no qual receberam a injeção intraimplante de 30L de solução salina e três grupos tratados (T1h, T4h e T24 h), no qual receberam a injeção intraimplante de 30L (0,5 g) do veneno de L. similis. Após os intervalos de 1, 4 e 24 horas os animais foram eutanaziados, os implantes foram colhidos e processados para microscopia de luz e eletrônica. À microscopia de luz observouse, nos implantes injetados com veneno, inflamação aguda com intenso edema, presença de trombos ocludentes, vasculite, aumento dos índices de mastócitos e de desgranulação de mastócitos e de apoptose de células gigantes. Além disso, observou-se degradação de colágeno dos tipos I e III. As análises das ultraestruturas evidenciaram-se vários tipos celulares em apoptose. Os presentes resultados sugerem que a apoptose, a desgranulação de mastócitos e a degradação do colágeno são importantes na patogenia do loxoscelismo e sua ocorrência em alguns tipos celulares pode explicar a dificuldade no reparo da úlcera que comumente se observa no loxoscelismo.Envenomation by Loxosceles spider bite leads to a set of signs and symptoms, called loxoscelism, which in most cases manifests through the dermonecrotic frame. The development of a smaller size animal model, of easy handling and maintenance, and lower cost is needed to study the loxoscelism pathogenesis. The inflammatory effects of the Loxosceles similis crude venom was evaluated considering neutrophil and macrophage activation, vasodilatation, hyperhaemia, edema, hemorrhage and TNF- and VEGF production using the murine sponge implant model. Thirty two, male, Swiss mice (68 weeks old) were implanted subcutaneously with polyetherpolyurethane sponge discs. Fourteen days post implantation, animals were separated into two groups: (1) control group16 mice received 30 L of saline intra-implant; (2) treated group-sixteen mice injected with 0.5 g/30 L of L. similis crude venom intra-implant. The animals were euthanized with xylazine/ketamine after 1 and 4 h post-injection. Microscopically, implants of the treated groups presented an acute inflammation characterized by: neutrophilic infiltrate, edema, vasodilatation, hyperhaemia, and severe hemorrhage. Some vessels presented ruptured walls. Under morphometric analysis, vessel area was bigger in the treated groups compared with the control ones. The biochemical parameters, hemoglobin content, levels of the cytokines tumor necrosis factor (TNF) and vascular endothelial growth factor (VEGF), inflammatory enzyme activities n-acethyl--glucosaminidase (NAG) and myeloperoxidadase (MPO) were also significantly higher in the venom-treated groups. The effects of Loxosceles venom in the granulation tissue of the implant in mice were similar to those observed in cutaneous loxoscelism in other species (human and rabbits). Consequently, the murine sponge implant model provides a new method to investigate cellular/molecular mechanisms associated with cutaneous loxoscelism.Envenomation by the Loxosceles spider causes loxoscelism, a pattern of signs and symptoms that primarily manifests in the dermonecrotic form. Our studies have shown that a mouse subcutaneous sponge implantation model may be useful in evaluating the effects of Loxosceles similis venom. This model provides an ideal microenvironment in which to study loxoscelism; however, it is still important to evaluate its pathogenesis and to observe the effects of L. similis venom for longer time periods than those in previous studies of this model. The aims of this study are: (1) to histologically characterize the effects of L. similis crude venom in a subcutaneous sponge implant; (2) to quantify the mast cells present in the implant and to measure their degranulation activity; (3) to quantify collagen subtypes I and III; and (4) to verify, quantify, and evaluate the effects of apoptosis in the implant on the pathogenesis of loxoscelism at 1h, 4h, and 24 h after injecting the venom. Thirty Swiss mice (6-8 weeks, male) were subcutaneously implanted with polyester-polyurethane sponge discs. Fourteen days post-implantation, the animals were divided into six groups (5 animals per group): three control groups (C1h, C4h, and C24h), in which the mice received 30 l injections of intra-implant saline, and three treated groups (T1h, T4h, and T24h), in which the mice received 30 L (0.5 g) injections of L. similis crude venom at 1h, 4h, and 24 h intervals. After each time interval, the animals were euthanized, and the implants were harvested and processed for light and electron microscopic analyses. The following results were observed in the implants harvested from the treated groups: acute inflammation with marked edema, thrombus, and vasculitis, as well as increased levels of mast cells and mast cell degranulation, and apoptosis in giant cells. Furthermore, degradation of collagen types I and III was observed. An analysis of the ultrastructure revealed apoptosis in various cell types. The present results suggest that apoptosis in some cell types associated with an increase in mast cell degranulation and the degradation of collagen fibers are important in the pathogenesis of loxoscelism therefore may explain the difficulty in repairing the ulcer is commonly observed in severe cases of loxoscelism cutaneous in humans

Apoptose na patogenia do do loxoscelismo cutâneo experimental em coelho: abordagens morfológica e imunoistoquímica

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-12T22:56:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_n_bia_b._pereira.pdf: 5192090 bytes, checksum: 45e3af0a8b4a95e59a8cbaf91d7e12c7 (MD5) Previous issue date: 26Acidentes com aranhas do gênero Loxosceles são um problema de relevância médica no Brasil. A picada da Loxosceles induz lesão dermonecrótica e hemorrágica, acompanhada, em alguns casos, de manifestações sistêmicas. A lesão dermonecrótica é antecedida pela trombose nos plexos dérmicos pró ximos ao local da picada. Recentemente, tem-se mostrado que a descamação de células endoteliais na proximidade da placa ateromatosa via apoptose predispõe à trombose. Apoptose é um tipo de morte celular que se processa com gasto de energia, além de síntese e degradação proteicas. Ainda não há, na literatura, a descrição das lesões histológicas produzidas pelo veneno da L. similis e, tampouco, estudos in vivo que demonstrem se o mesmo induz apoptose de células endoteliais. Os objetivos deste estudo foram: (1) analisar histologicamente e relatar, pela primeira vez, a lesão induzida na pele de coelhos injetados com o veneno de L. similis e (2) avaliar a importância da apoptose no mecanismo do loxoscelismo. Foram utilizados 40 coelhos Nova Zelândia, machos que foram divididos em 2 grupos: (1) controle injetados intradermicamente com 50 µl de PBS e (2) tratado injetados intradermicamente com 0,5 µg de veneno bruto diluído em 50 µl de PBS. Os grupos foram analisados 2, 4, 6 e 8 horas após a injeção. Fragmentos de pele foram colhidos, fixados em formol tamponado a 10% e processados rotineiramente para a inclusão em parafina. Cortes de 5 µm foram corados em HE. Algumas secções foram submetidas à reação de TUNEL e a imunoistoquímica para Bax. Algumas amostras de pe le foram também fixadas em glutaraldeído para inclusão em metacrilato. Secções de 3 µm foram coradas em HE. A análise microscópica mostrou que o veneno bruto da L. similis induz a uma lesão caracterizada por: edema envolvendo toda a derme e se estendendo a té o músculo cutâneo, trombose em todas as camadas da derme, infiltrado inflamatório predominantemente heterofílico, necrose fibrinóide em paredesarteriolares, hemorragia dérmica e necrose do músculo cutâneo. A intensidade da lesão progrediu com o intervalo de tempo. Além destas alterações, a partir de 2 horas de injeção do veneno, observou-se, em alguns vasos, a presença de células endoteliais contraídas, apresentando perda de adesão entre si e com a matriz extracelular (anoiquia), contendo núcleo retraído, carioteca irregular e cromatina condensada, caracterizando apoptose. Algumas secções foram submetidas à reação de TUNEL e a imunoistoquímica para Bax. A consequente descamação do endotélio via apoptose parece ser o principal fator indutor de trombose nos plexos dérmicos que culmina com a dermonecrose característica do loxoscelismo cutâneo. Com base no presente estudo pode -se concluir que o veneno de L. similis induz apoptose de células endoteliais.Accidents with Loxosceles spiders represent a relevant medical problem in Brazil. The Loxosceles bite to a dermonecrotic and hemorrhagic injury that can be followed by systemic manifestations. The dermonecrotic injury is preceded by thrombus formation in dermal vessels near to the bite site. It was shown recently that apoptosis of endothelial cell surrounding atherosclerotic plaques predisposes to thrombosis. Apoptosis is a kind of cellular death that is carried out with e nergy expenditure, besides protein synthesis and degradation. Up to now, there are no studies in vivo showing whether the poison of L. similis induces apoptosis of endothelial cells. Additionally, there are no descriptions of the histological lesion induced by the L. similis bite. The aim of this study is: (1) to analyze histologically at first, the induced injury in the skin of rabbits inoculated with the poison and (2) to evaluate the importance of apoptosis in the mechanism of the loxoscelism. Forty male rabbits were divided in 2 groups: (1) control - inoculated intradermically with 50 µl of PBS and (2) treated- inoculated intradermically with 0,5 µg of the L. similis crude venom diluted in 50 µl of PBS. Animals were analyzed 2, 4, 6 and 8 hours after inoculation. Fragments of skin were collected, fixed in 10% buffered formalin, routinely processed and paraffin embedded. Sections of 5 µm were stained with HE. Some sections were submitted to the TUNEL reaction and other sections were submitted to immunohistochemical detection of Bax. Skin samples were also fixed in glutaraldehyde and embedded in methacrylate. Sections 3 µm thick were stained with HE adapted to methacrylate. The crude L. similis venom induces a lesion characterized by oedema, inflammatory infiltrate predominantly heterophilic, fibrinoid necrosis of the arterial and arteriolar walls, thrombosis in all dermal layers and necrosis of the cutaneous muscle whose intensity progressed with the time interval. The lesion intensity increased with the inoculation time becoming into severe heterophilic dermatitis 8 hours post inoculation. A similar lesion is observed in experiments using the crude venom of other Loxosceles species. Additionally, 2 hours post inoculation, shrunken endothelial cells were noted, losing adhesion one to another and to the extracellular matrix (anoykic cells), containing basophilic nuclei, and condensed chromatin, suggesting apoptosis. Some sections were subjected to TUNEL assay and immunohistochemistry for Bax. Present data suggest that the crude L. similis venom induces apoptosis of endothelial cells. On the basis of the present study it can be concluded that the poison of L. similis induces apoptosis of endothelial cells

Double immunofluorescence labeling for CD31 and CD105 as a marker for polyether polyurethane-induced angiogenesis in mice

A crucial component of the integration between foreign implants and the host is angiogenesis. However, to date, none of the available techniques and/or endothelial markers employed to assess angiogenesis in the implant/host interface seems to be able to highlight vascular structures convincingly. In the present study we investigated and compared the expression of two endothelial cell markers: platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1) (CD31) and endoglin (CD105) using immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) to identify and quantify newly formed blood vessels in subcutaneous implants of polyether-polyurethane sponge of formalin-fixed paraffin-embedded tissue. At day 14 post implantation the discs of the synthetic matrix were removed and processed for histological and morphometric analysis. In IHC staining for CD31 antibody the number of vessels was 2.27±0.69 and 5.25±0.46 for CD105. In IF for CD31 the number of vessels was 15.36±1.295 and 10.54±0.8213 for CD105. The level of cross-reaction was lesser in IF images compared with IHC images. Colocalization of CD31/CD105 using confocal images showed positive correlation (Pearson's co-relation and Manders’ equation). The double labeling for blood vessels using the IF technique for CD31/CD105 may be an important tool for evaluation of angiogenesis in biomaterial/host integration

Apoptose e maturação placentária bovina: um estudo imunohistoquímico e morfométrico

Resumo: A liberação da placenta após o parto envolve a perda da adesão materno-fetal e ocorre somente após a maturação completa do placentoma, que está relacionada com a diminuição da celularidade dos tecidos fetal e materno. A apoptose é requerida tanto para a maturação quanto para a liberação normal da placenta após o parto. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de apoptose em amostras de placenta de vacas em diferentes fases de gestação. Amostras de placentomas de 15 vacas saudáveis com 4 (n=5), 6 (n=5) e 9 (n=5) meses de gestação foram colhidas e processadas rotineiramente para a histologia, imunoistoquímica e histoquímica. As lâminas obtidas foram coradas em HE, Picrosirius Red e submetidas à análise imunoistoquímica das proteínas Caspase 3, Caspase 8, Bax e Bid. O aumento no número de vasos não necessariamente se associou ao aumento do calibre destes durante a evolução da gestação. Os resultados de histomorfometria revelaram aumento da marcação para Bax e Caspases 3 e 8 em células trofoblásticas binucleadas no final da gestação, enquanto o Bid se manteve sem alteração significativa. A histomorfometria das células trofoblásticas mononucleadas revelou expressão alta para Bax no início de gestação, com diminuição aos 6 meses de gestação e aumento das imunomarcações para Caspases 3 e 8, e Bid com o avanço gestacional. Os colágenos tipo I e III não aumentaram do terço médio ao final da gestação, o que é importante para a diminuição da adesão materno-fetal. Esses resultados confirmam que as Caspases 3 e 8, e o Bax estão envolvidos nos mecanismos de ativação da apoptose pela via intrínseca mitocondrial e/ou extrínseca ao longo da gestação em células trofoblásticas binucleadas, e que nas células trofoblásticas mononucleadas o Bax deixa de ser importante, enquanto o Bid e as Caspases 3 e 8 se tornam os mais significativos