REACTIVE OXYGEN SPECIES, OXIDATIVE DAMAGE, AND ANTIOXIDANT DEFENSE MECHANISMS: IN HUMANS AND IN VITRO ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE SPIN-TRAPPING STUDIES

Scopo della ricerca sviluppata durante questi tre anni di Dottorato \ue8 quello di spiegare i meccanismi sottesi alla risposta allo stress ossidativo nell'uomo a livello integrativo e molecolare. Per questo fine, nel primo anno di Dottorato, si \ue8 innanzi tutto implementato un metodo quantitativo assoluto atto a valutare la produzione dei radicali liberi. Come \ue8 noto ci\uf2 che importa \ue8 l\u2019equilibrio tra produzione di Specie Reattive dell\u2019Ossigeno (ROS) e la disponibilit\ue0 di difese antiossidanti. Quando questo equilibrio viene meno, si parla di Stress Ossidativo, con conseguenze a carico degli acidi nucleici, dei lipidi e delle proteine, compromettendo il metabolismo e la vitalit\ue0 cellulare, fino a indurre apoptosi o necrosi. Questo \ue8 un fenomeno ricorrente in molte malattie acute e croniche oltre che nel fisiologico processo di invecchiamento. Allo scopo si \ue8 utilizzata la tecnica di Risonanza Paramagnetica Elettronica (EPR) accoppiata a specifiche sonde molecolari (spin trapping) per sviluppare un metodo quantitativo \u201cin vivo\u201d in grado di monitorare la produzione di ROS in campioni biologici quale il sangue e sue frazioni. Gli inizi del mio periodo di Dottorato sono fortunatamente coincisi con l\u2019acquisizione da parte dell\u2019Istituto di Bioimmagini e Fisiologia Molecolare (IBFM) del CNR (Lita di Segrate), di uno strumento EPR che risponde alle esigenze di maneggevolezza e portabilit\ue0 (e-scan Bruker BioSpin, Germania), di recente immissione sul mercato, che opera in onda continua (CW), nella banda X delle \ub5W, in grado di rilevare concentrazioni molto basse (nM) in piccoli campioni (50 \ub5l), utilizzando una cavit\ue0 risonante le cui propriet\ue0 ottimizzano il fattore di riempimento, conferendo un\u2019elevata sensibilit\ue0 allo strumento. L\u2019attendibilit\ue0 dell'efficacia del metodo sviluppato \ue8 stata verificata con correlazioni tra metodi classici enzimatici e misure EPR in vari stati: fisiologici e parafisiologici. Trattandosi della messa a punto di un metodo di misura completamente innovativo e mancando pertanto dati di letteratura cui fare riferimento, si sono rese necessarie molte prove sperimentali da campioni ematici, in un vasto gruppo di soggetti, con tantissime acquisizioni modificando e ottimizzando di volta in volta i parametri e le condizioni (T, pO2) Questo procedimento \ue8 stato lento e laborioso; una volta superate le difficolt\ue0 tecniche, si \ue8 avuto a disposizione un piccolo catalogo di misurazioni che \ue8 servito ad ottenere i primi dati sperimentali che saranno illustrati nei primi paragrafi di questa tesi. Si \ue8 inoltre cercata una correlazione statistica tra la produzione di ROS determinata con tecnica EPR ed i marcatori dello stress ossidativo ottenuti dai vari test convenzionali enzimatici riportati in letteratura quali il dosaggio da sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS) e carbonili proteici (PC) in grado di quantizzare il danno \u201ca posteriori\u201d prodotto dai ROS su lipidi e proteine rispettivamente. Una correlazione sistematica tra i dati EPR e i dati enzimatici non era certa, in quanto questi ultimi rivelano un danno conclamato. Tuttavia, \ue8 stata trovata una significativa correlazione (ANOVA, p<0.05) in soggetti a riposo, tra la produzione di ROS/TBARS e PC (rispettivamente: r2=0.74 e r2=0.60). Per rispondere allo scopo della ricerca, abbiamo assunto come modello l\u2019ipossia studiata 1) come situazione che induce uno sbilanciamento tra Stress Ossidativo e capacit\ue0 antiossidante e 2) nel tentativo di identificare i possibili meccanismi di ripristino dell\u2019equilibrio. Dall'insieme dei dati raccolti, al di l\ue0 dei risultati specifici, possiamo evincere che anche se la misura quantitativa assoluta della produzione di ROS (umol . mim-1) non pu\uf2 essere un parametro generalizzato, perch\ue9 funzione di variabili fisico-chimiche (pO2, Temperatura, concentrazione della sonda), acquisizione ed elaborazione dei parametri vanno comunque prese in considerazione. Dal calcolo dei limiti di detenzione (LOD): 30 \ub7 10-3 mM, e quantificazione (LOQ): 100 \ub7 10-3 mM, lo strumento si \ue8 rilevato sensibile e affidabile. Allo stesso tempo, va tenuto presente che il dato ottenuto rappresenta la produzione di ROS non tamponati dal sistema antiossidante. Per questo, si \ue8 ritenuto che la misura su campione ematico fosse rappresentativa della risposta sistemica integrativa. In particolare, il sangue capillare, oltre alla sua elevata sensibilit\ue0 e riproducibilit\ue0 (0,5% di differenza tra misure ripetute), ci ha permesso di disegnare un protocollo agile mini-invasivo. Da quanto fin qui esposto, possiamo ricavare che, al di l\ue0 della ricerca di un dato assoluto da riportare in letteratura, \ue8 una valida procedura che ogni soggetto, monitorato nel tempo risulti controllo di se stesso, ovvero che a indice della risposta equilibrio/squilibrio vengano quantizzate le variazioni. Nel tentativo di identificare i possibili meccanismi di ripristino dell\u2019equilibrio dello stress ossidativo, gli esperimenti sono stati condotti su: A) soggetti sani, che come tali sono caratterizzati da una condizione di equilibrio tra ROS e difese antiossidanti, B) soggetti affetti da patologie neurodegenerative, per i quali era logico attendersi, come confermato dalla realt\ue0, che fossero caratterizzati da una condizione di conclamato squilibrio, rivelabile da un significativo incremento di ROS prodotti in condizioni di riposo. In soggetti sani, si sono disegnati, messi a punto e applicati differenti protocolli sperimentali, per testare l\u2019effetto: a) dell\u2019esercizio fisico (stato ipossico transitorio) di breve (hockeisti e nuotatori) e lunga durata (atleti di triathlon); b) dell\u2019allenamento (nuotatori); c) dell\u2019ipossia normobarica e ipobarica acuta e prolungata (giovani soggetti sedentari); d) dell\u2019assunzione di molecole antiossidanti sulla produzione di ROS. In patologie neurodegenerative (pazienti affetti da: Neuropatia Diabetica (tipo II DN), decadimento cognitivo lieve (MCI) e Sclerosi Laterale Amiotrofica sporadica (sSLA)) dopo aver rilevato uno squilibrio in condizioni basali, \ue8 stato studiato l\u2019effetto dell\u2019esercizio/allenamento (SLA) o dell\u2019assunzione di antiossidanti (tipo II DN) sulla possibilit\ue0 di un potenziale ripristino a valori di equilibrio. Importanti risultati sono emersi dall\u2019analisi dei dati registrati nelle varie condizioni sperimentali e sono illustrati in questa tesi. ll tema comune di tutti i test, oltre all\u2019evidente studio sulla produzione dei ROS, \ue8 stato quello dell\u2019ipossia. Infatti l\u2019Ipossia, nelle sue varie espressioni (intese come deficienze parziali o totali di O2 nel nostro organismo), \ue8 stato elemento caratterizzante in tutti i protocolli che abbiamo testato. I protocolli di studio su pazienti sono tuttora in corso; pertanto i dati illustrati devono intendersi come preliminari. Nei soggetti patologici si \ue8 costatata una differente produzione di ROS in condizioni di riposo, mostrando un valore significativamente (p<0,05) pi\uf9 alto nei pazienti affetti da SLA (+20%) rispetto ai soggetti sani. L\u2019allenamento, in questi pazienti, sembra giocare un ruolo favorevole nel diminuire la produzione di ROS: un decremento del 7% \ue8 stato calcolato nei valori a riposo pre e post allenamento. Un sicuro effetto positivo dell\u2019allenamento controllato, dopo otto settimane, \ue8 stato osservato nei nuotatori (-25%) sulla produzione di ROS (2.24 \ub1 0.14 \u3bcmol \ub7 min-1). Tutti questi esperimenti sono stati condotti e i risultati ottenuti durante il secondo e terzo anno della mia Scuola di Dottorato. A parte gli specifici risultati ottenuti dal set di dati raccolti, osservazioni generali possono essere riassunte come segue: 1) Non vi \ue8 alcun modo per ottenere dati per quantificare il volume totale di ROS prodotta da un soggetto in qualsiasi condizione. Il dato EPR ricavato dalle misurazioni rappresenta l\u2019eccesso di ROS che il sistema ha prodotto (\u3bcmol \ub7 min-1) in una determinata condizione, ed \ue8 quindi un tasso di produzione di ROS Inoltre si \ue8 scelto di effettuare la misura da sangue invece che da campioni di tessuto in modo da ottenere dati il pi\uf9 possibile sistematici. In particolare, il sangue capillare (rispetto al sangue venoso o plasma) ha dato la possibilit\ue0 di sviluppare un metodo di misurazione affidabile, relativamente semplice e mini-invasivo. Tuttavia quando si passa da misurazioni di sangue capillare a venoso, bisogna prendere in considerazione la differente pO2. (la produzione di ROS in sangue venoso \ue8 stata trovata circa il 18% inferiore a quella nel sangue capillare: 1.79 \ub1 0.12 vs 1.48 \ub1 0.29 \u3bcmol\ub7min-1 rispettivamente). 2) I dati non possono essere presi come parametri generali, poich\ue9 dipendono strettamente da variabili fisico-chimiche (T, pO2) Da tutti questi punti, si pu\uf2 evincere che, al di l\ue0 della ricerca di un dato assoluto da riportare in letteratura, \ue8 una valida procedura che ogni soggetto, monitorato nel tempo risulti controllo di se stesso, ovvero che a indice della risposta equilibrio/squilibrio vengano quantizzate le variazioni. 3) Tuttavia si \ue8 consapevoli che il dato fornito da EPR deve essere integrato con dati sistemici quali: analisi ematochimiche di laboratorio (ematocrito, ferro, colesterolo, piastrine, neutrofili, linfociti, monociti), saturazione dell\u2019ossigeno, cinetica degli scambi gassosi (VO2max). Si ritiene che il metodo possa trovare applicazione i) medicina dello sport offrendo un valido aiuto nei centri sportivi per monitorare l\u2019efficacia dell\u2019allenamento e gli eventuali effetti dello stress provocato ed eventualmente migliorare i protocolli; ii) alla medicina di montagna per lo studio delle patologie da alta quota, poich\ue9 l\u2019ipossia \ue8 il primo e pi\uf9 delicato problema dell\u2019altitudine sin dalla quota media (1800m); iii) ai centri clinici/diagnostici per monitorare gli effetti delle terapie/trattamenti sulla progressione di patologia. Seconda parte della mia attivit\ue0 di ricerca, \ue8 stato lo studio in vitro dell\u2019ipossia da un punto di vista molecolare mediante misurazioni spettroscopiche EPR. Partendo da una visione molecolare, l\u2019ipossia orchestra una moltitudine di processi e di pathway molecolari. Nel tradizionale meccanismo dell\u2019ipossia si ha la presenza di una proteina eme in grado di rilevare il legame reversibile di O2 il quale causa un cambiamento allosterico nell\u2019emo-proteina: da inattivo (forma ossigenata) ad attivo (forma de-ossigenata). Quindi l'attivit\ue0 di una proteina emo \ue8 determinata dalla presenza o assenza dell\u2019ossigeno legato. Nella presente ricerca, la rilevanza di stati ipossici, dal punto di vista molecolare, atti ad essere rilevati sia in condizioni fisiologiche che patologiche \ue8 stato attribuito all\u2019Ossido Nitrico (NO) e al ruolo della Mioglobina (Mb). E\u2019 noto, infatti, che l\u2019NO \ue8 un radicale libero particolarmente espresso in condizioni ipossiche in quanto \ue8 in grado di regolare la vasodilatazione, quindi aumenta l\u2019afflusso di sangue e al tempo stesso pu\uf2 essere per\uf2 dannoso andando ad inibire la catena respiratoria a livello del complesso IV. In letteratura sono riportate cinque isoforme di Mb umana (Mb I-V) presenti nel muscolo scheletrico in percentuali diverse (Mb I: 75%; Mb II: 20%; Mb III-V: 5%) le cui funzioni non sono ancora state chiarite. Prendendo a riferimento Mb II, queste proteine differiscono solo per un singolo residuo aminoacidico: E54K (Mb I), K133N(Mb III), R139Q (Mb IV) a R139W (Mb V). Inoltre popolazioni tibetane, native dell\u2019alta quota, presentano come risposta all\u2019ipossia alte capacit\ue0 antiossidanti, alto flusso ematico sistemico, metabolismo ed efficienza meccanica migliore, alti livelli di metaboliti circolanti biologicamente attivi all\u2019NO e sono caratterizzate da un significativo aumento della concentrazione di Mb a livello muscolare con particolare riferimento all\u2019 isoforma 54E (Mb II). Il presente studio, grazie all\u2019analisi combinata EPR e simulazioni di Dinamica Molecolare (MD), contribuisce ulteriormente a sottolineare il ruolo importante svolto dalla Mb in condizioni di ipossia; inoltre segna un primo passo verso l'identificazione dei diversi ruoli svolti dalle isoforme della Mb Importanti risultati funzionali si sono ottenuti dallo studio EPR: l\u2019NO ha capacit\ue0 di legame significativamente maggiore con l\u2019isoforma 54E rispetto all\u2019isoforma 54K; questa \ue8 pi\uf9 circoscritta alla struttura dello stato de-ossigenato e la capacit\ue0 di legame diventa significativamente inferiore (p<0.01) e quasi identica per le due proteine in presenza di O2 anche a differenti livelli di pO2 (40 e 100 mmHg). Concludendo, osservazioni e prospettive future possono essere condensate nella convinzione, che confidiamo saranno condivise e verificate anche dal lettore, della validit\ue0 del nuovo del metodo sviluppato e dei dati raccolti. Alcuni risultati, in particolar modo quelli concernenti gli stati patologici, sono da considerarsi preliminari; tuttavia la strada da percorrere \ue8 estremamente interessante e richiede ulteriori indagini.The aim of the research developed in the time course of the three years of my Doctoral course in Molecular Medicine was to shed light into the mechanisms involved in Oxidative Stress responses in man at both integrative and molecular levels. To reach this general and high-level purpose we firstly focused our attention towards developing a method capable of returning an absolute quantitative estimation of Free Radicals production level. This particular aim was the subject of the first year of my researching activity. As a matter of fact, as is well known, in any physiological and/or pathological condition a subject could be involved, \u2018oxidative stress\u2019 results from the imbalance between Reactive Oxygen Species (ROS) production and his antioxidant capacity. Electron Paramagnetic Technique (EPR) resulted the method of choice since, as is well known, it is the only technique capable of returning, in a non-invasive way, the \u2018intrinsic\u2019 quantitative information (the signal is proportional to the number of excited electron spins). Indeed the beginning of my Doctoral period fortunately coincided with the acquisition by the Molecular Bioimaging and Physiology (IBFM) Institute of CNR (Lita Segrate) of an EPR instrument (e-scan Bruker BioSpin, Germany) of recent design, responding to the innovative characteristics of easy portability and handling. The spectrometer operates at the common X-Band microwave frequency and deals with very low concentration levels (nM) even in small sample volumes (50 \u3bcl). Aware of the novelty of the method, we first looked for a correlation between the attained EPR experimental data and those returned when adopting the classical enzymatic methods (e.g. ThioBarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) and Protein Carbonyls (PC) data collected from the same subject). Indeed, a correlation could not, by principle, be expected, since, compared to the EPR data, enzymatic methods give a quantitative \u201ca posteriori\u201d evaluation of the damage produced by ROS, on lipids and cellular proteins. As a matter of fact, a positive correlation (ANOVA, p<0.05) was found between EPR ROS production data and TBARS (r2 ~ 0.7) as well as PC concentration (r2 ~ 0.6), which was found in resting subjects. Then, in order to achieve the overall objective of the research, we assumed \u2018hypoxia\u2019 as the \u2018particular\u2019 condition to be investigated, since it was viewed as a peculiar state capable of: 1) producing un imbalance between oxidative stress and anti-oxidant capacity; 2) offering the possibility of the identification of mechanisms involved in the perturbed balance restoring. To attain this \u2018secondary\u2019 aim, the experiments were carried out on: A) healthy subjects, that as such, were expected to start from a balance equilibrium condition; B) subjects affected by neurodegenerative pathologies, for whom, on the contrary, a sure imbalance condition was expected, that would be confirmed by a significant increment of ROS production, even at rest. However a fully innovative method had been developed, so that we lacked of referring literature data: a series of preliminary measurements on a homogeneous group of healthy subjects had to be firstly carried out, not only to optimize the acquisition and environmental conditions (T, pO2 that have to be carefully defined since they greatly affect EPR data), but also to reach reliable resting physiological values and range of variability. A great reproducibility of the data (\u3bcmol . min-1) was found on blood capillary samples taken from the same healthy subject six hours apart (r\ub2 = 0.99, ~ 0.5% discrepancy) and was calculated; limit of detection (LOD) and quantification (LOQ) of 30 19 10-3 mM and 100 19 10-3 mM were calculated respectively. In healthy subjects, the experimental protocols were designed in order to study the effects of: a) exercise (as inducing a transitory hypoxic state) of both short (in hockey players, swimmers) and long duration (in triathletes); b) training (as inducing a balance restore, in swimmers); c) hypoxia, both hypo- and normobaric (to study the effect of the assumed model condition itself, in young sedentary subjects); d) antioxidant molecules administration as an external way helping to restore the balance. In neurodegenerative pathologies (patients affected by: type II Diabetic Neuropathy (type II DN), Mild Cognitive Impairment (MCI) and sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis (sALS)) after checking the expected unbalance throughout a significant increase of ROS production (sALS versus healthy subjects: +20%, p<0.05) under resting conditions, the effect of training on the possibility of approaching a normal ROS production level was investigated. The collected data thus far, that have to be nevertheless considered as preliminary results, of the training effect in sALS patients showed a beneficial effects; an decrease ROS production resting value (about -7%) was calculated after twelve weeks of training by the patients. in swimmers a significantly lower (about -25%) basal ROS production value (2.24 \ub1 0.14 \u3bcmol \ub7 min-1) after eight weeks training period was calculated. All these experiments were carried out and results obtained during my second and third year of my Doctoral School. Besides and beyond the specific results obtained from the collected data set, pointed out throughout my thesis, general observations can be summarized as follows: 1) There is no way to obtain data quantifying the total amount of ROS produced by a subject under any condition. Rather, EPR data return amount of ROS there were not scavenged by the antioxidant system. In other words, under a given condition, they represent the excess of the ROS produced in a given time, that is ROS production rate (\u3bcmol \ub7 min-1). Moreover we chose to carry out the measurement on blood instead of tissue samples to obtain most possible integrative data. In particular capillary blood (with respect to venous blood or plasma) gave us the opportunity of developing a mini-invasive, reliable and easy measurement method. Nevertheless when going from capillary to venous data, the different blood pO2 must be taken into account. (ROS production in venous was found about 18% lower than in capillary blood: e.g. 1.79 \ub1 0.12 vs 1.48 \ub1 0.29 \ub5mol \ub7 min-1 respectively). 2) The obtained data cannot be taken as general parameters, since they strictly depend on the physic-chemical variables (T, pO2) assumed for the measurement that must be taken into great account. From all these considerations, we can therefore conclude that beyond the possibility of obtaining absolute data to report for the first time in literature, this method was found as quite a sensitive and reliable mean to monitor the changes of each subject during time progression, therefore making each subject the control. 3) Despite the reliability and high reproducibility of the afore-developed method, we are anyway aware that EPR data have to be compared and integrated by collecting systemic data: hematochemical parameters (e.g. hematocrit, iron, cholesterol, platelets, neutrophils, lymphocytes, monocytes), oxygen saturation, maximal oxygen consumption (VO2max). Finally we are confident that our method will be in the near future considered suitable to be applied into different medical fields: i) sport medicine, as an effective available help in sports centers to set up and adjusts training protocols by monitoring training effects on oxidative stress. ii) mountain medicine, in studying pathologies induced by hypoxia following high altitude acute and chronic staying; iii) clinic and diagnostic centers, helping in monitoring progression of pathologies and/or effects of therapies. On the other side, second part of my researching activity, the study of hypoxia throughout EPR measurements, was carried out in vitro at a molecular level. In fact, hypoxia orchestrates a multitude of processes of molecular pathway responses. Nevertheless the traditional mechanism of sensing hypoxia involves the presence of a heme protein so that hypoxia can be detected by a reversible binding of O2 at the heme site, which causes an allosteric shift in the hemoprotein from inactive (oxyform) to active (deoxy) form. The activity of a hemoprotein is therefore determined by the presence or absence of bound oxygen. Among heme proteins, the relevance of hypoxic state

A quantitative method to Monitor Reactive Oxygen Species (Ros) production by electron Paramagnetic Resonance (Epr) in phisiological and pathological conditions

The growing interest in the role of Reactive Oxygen Species (ROS) and in the assessment of oxidative stress in health and disease clashes with the lack of consensus on reliable quantitative noninvasive methods applicable. The study aimed at demonstrating that a recently developed Electron Paramagnetic Resonance microinvasive method provides direct evidence of the "instantaneous" presence of ROS returning absolute concentration levels that correlate with "a posteriori" assays of ROS-induced damage by means of biomarkers. The reliability of the choice to measure ROS production rate in human capillary blood rather than in plasma was tested (step I). A significant (P < 0.01) linear relationship between EPR data collected on capillary blood versus venous blood (R-2 = 0.95), plasma (R-2 = 0.82), and erythrocytes (R-2 = 0.73) was found. Then (step II) ROS production changes of various subjects' categories, young versus old and healthy versus pathological at rest condition, were found significantly different (range 0.0001-0.05 P level). The comparison of the results with antioxidant capacity and oxidative damage biomarkers concentrations showed that all changes indicating increased oxidative stress are directly related to ROS production increase. Therefore, the adopted method may be an automated technique for a lot of routine in clinical trials

Acute Hyperbaria and Hyperoxia Effects on Oxidative Stress Kinetic Response: A Simulated Study

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EFFECTS OF ACUTE OR CHRONIC HYPOXIA ON REACTIVE OXYGEN SPECIES PRODUCTION ASSESSED BY ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE

There is indirect evidence from cells and tissue experiments that acute hypoxia induces accumulation of reactive oxygen species (ROS). This is also the case for the whole body of animals and man as appears from muscle proteomic analysis. Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) is the only non-invasive technique available to detect and quantitate ROS accumulation. By means of a recently developed EPR Scanner (Bruker e-scan) suitable for 50 \uecl sample analysis and sensitive to very low (nM) concentration levels, the time course of ROS in capillary blood could be monitored: a) in sedentary subjects (n=6) at the onset (square wave), during and after 2-4 h of acute hypoxic exposure (equivalent to 4500 meters a. s.l.); b) in athletes (n=18) before and after 2wk exposure to moderate altitude (1860m). The data were compared with complementary enzymatic assays of Protein Carbonyls, PC and ThioBarbituric Acid Reactive Substances, TBARS. Results: In (a), a fast, initial elevation of ROS was observed, whose size appears to be related to the subjects\u2019 capillary PO2, followed within 2 h by a return to pre-hypoxia levels. Parenthetically, plasmatic concentrations of TBARS and PC were significantly increased after 4 h of hypoxia exposure and up to 1 h into recovery, then resuming pre-hypoxia levels within 8 h; (b) two weeks exposure to moderate hypoxia induced significant increases in both ROS and oxidative markers concentration. The experimental conditions under investigation, even though very different for degree of hypoxia and duration, were both characterized by comparable accumulation of ROS and oxidative damage

Moderate Intensity Resistive Training Reduces Oxidative Stress and Improves Muscle Mass and Function in Older Individuals

An innovative moderate-intensity resistive exercise-training (RT) program was tested in thirty-five sarcopenic elders (SAR). The subjects were randomized into two groups: SAR training (SAR-RT), n = 20, 73.0 \ub1 5.5 years, or SAR non-training (SAR-NT), n = 15, 71.7 \ub1 3.4 years. The training consisted of 12-week progressive RT, thrice/week, at 60% one-repetition maximum (1RM), 3 sets, 14-16 repetitions for both upper and lower limbs. The pre and post intervention measurements included: the skeletal muscle index (SMI%); strength (1RM); stair-climbing power (SCP); muscle thickness (MT) of vastus lateralis (VL) and elbow flexors (EF), VL pennation angle (PA), rectus femoris (RF) anatomical cross-sectional area (ACSA); reactive oxygen species (ROS), total antioxidant capacity (TAC), protein carbonyls (PC), thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), 8-isoprostane (8-iso-PGF2-\u3b1), 8-OH-2-deoxyguanosine (8-OH-dG), as markers of oxidative stress/damage (OxS). In SAR-RT, SCP increased by 7.7% (P &lt; 0.01), MT increased by 5.5% for VL, 10.4% for EF and PA increased by 13.4% for VL (P &lt; 0.001 for all). The RF ACSA increased by 14.5% (P &lt; 0.001). 1RM significantly increased by at least 67% for all muscles tested. Notably muscle strength (1RM) positively correlated (P &lt; 0.001) with TAC and negatively with PC (P &lt; 0.001). In conclusion, moderate intensity RT is an effective strategy to increase muscle mass and strength in SAR, while minimizing OxS

JAB1 deletion in oligodendrocytes causes senescence-induced inflammation and neurodegeneration in mice

Oligodendrocytes are the primary target of demyelinating disorders, and progressive neurodegenerative changes may evolve in the CNS. DNA damage and oxidative stress are considered key pathogenic events, but the underlying molecular mechanisms remain unclear. Moreover, animal models do not fully recapitulate human diseases, complicating the path to effective treatments. Here we report that mice with cell-autonomous deletion of the nuclear COP9 signalosome component CSN5 (JAB1) in oligodendrocytes develop DNA damage and defective DNA repair in myelinating glial cells. Interestingly, oligodendrocytes lacking JAB1 expression underwent a senescence-like phenotype that fostered chronic inflammation and oxidative stress. These mutants developed progressive CNS demyelination, microglia inflammation, and neurodegeneration, with severe motor deficits and premature death. Notably, blocking microglia inflammation did not prevent neurodegeneration, whereas the deletion of p21CIP1 but not p16INK4a pathway ameliorated the disease. We suggest that senescence is key to sustaining neurodegeneration in demyelinating disorders and may be considered a potential therapeutic target

Oxidative stress as a biomarker for monitoring treated celiac disease article

Introduction: High levels of reactive oxygen species (ROS) and impaired antioxidant defense systems lead to oxidative stress (OxS) and tissue injury in different intestinal and extra intestinal conditions, including celiac disease (CD). The aim of the present study was to investigate the role and potential use of ROS and other biomarkers of OxS in the clinical management of CD. Methods: We collected duodenal specimens and blood samples from na\uefve patients (N-CD), patients on a gluten free diet (GFD) including responders (CD-GFD) and non-responders (NRCD). We measured plasmatic ROS production (electron paramagnetic resonance, EPR), lipid peroxidation (thiobarbituric acid-reactive substances, TBARS), protein oxidation (protein carbonyl, PC), total antioxidant capacity (TAC), nitric oxides and glutathione (GSH) in erythrocytes. Results: Fifty-four patients affected by CD were enrolled (17 N-CD, 18 CD-GFD and 19 NRCD; 44 F; age 44 \ub1 13 years). A significant increase of plasmatic OxS biomarkers (ROS, peroxidated lipids, oxidized proteins, and nitrate concentrations) and decrease of antioxidant species (TAC and GSH levels) were found in NRCD and N-CD compared to CD-GFD. Comparably, a significant direct relationship between the severity of duodenal atrophy, ROS production rates and TBARS was found; conversely, TAC and GSH presented an inverse correlation. Discussion: OxS is involved in CD tissue damage and correlates with the degree of duodenal atrophy. These findings suggest the possible role of OxS biomarkers as indicators of CD activity during the clinical follow-up

Pathophysiology of spasticity

Spasticity arises from lesions involving the corticoreticulospinal system in the brain, brainstem or spinal cord. Abnormal suprasegmental influences lead to increased spinal cord excitability and to impairment of interneuronal systems thereby giving rise to increased muscle tone, enhanced stretch reflexes, muscle overactivity and antagonist muscle co-contraction. Additionally, muscle paresis and immobilisation in a shortened position result over time in structural changes that involve muscles, joint, tendons and bones and contribute to muscle stiffness. Spasticity is a complex motor disorder that arises from a central nervous system dysfunction and causes changes at all locomotor system levels, from the cerebral cortex to muscles, joints and bone