Chestnut blight in the Minho region. Population structure and genetic variability of Cryphonectria parasitica

O cancro do castanheiro (Cryphonectria parasitica) é considerado um dos principais fatores de mortalidade de Castanea sativa. Introduzido em Portugal e com desenvolvimento epidémico conhecido a partir da década de 90, manifestou elevada agressividade e uma dispersão muito rápida, tendo, atualmente, distribuição generalizada nas regiões de produção de castanheiro. Os meios de luta químicos, culturais e físicos não são eficazes no combate do cancro do castanheiro e apenas a luta biológica por Hipovirulência tem mostrado ser eficaz na Europa. A disseminação dos hipovírus está diretamente relacionada com os grupos de compatibilidade vegetativa (VCType), pelo que existe a necessidade de estudar a estrutura populacional de C. parasitica e identificar os VCType presentes em cada souto. Avaliou-se a incidência e severidade do cancro do castanheiro em três soutos da região do Minho, tendo-se obtido isolados de C. parasitica que foram posteriormente caracterizados quanto ao VCtype e avaliada a variabilidade genética das diferentes subpopulações através de box-PCR. Os isolados obtidos nos três soutos pertencem a cinco VCtype diferentes sendo o mais representativo o EU-11 (62% dos isolados), seguindo-se o EU-2 (20%), EU-1 e EU- 66 (5,5%) e EU-12 (7%). Os padrões de bandas obtidos por box-PCR não parecem refletir a virulência, origem geográfica ou VCtype dos isolados.Cryphonectria parasitica, the causal agent of chestnut blight, was considered one of the main factors of mortality of Castanea sativa. Introduced in Portugal in the 1990s, and with epidemic development, the disease has manifested high aggressiveness and a rapid dispersion. Currently it has a widespread distribution in the chestnut production regions. Chemical, physical and cultural control means are not effective to control Chestnut Blight and only biological control by hypovirulence has shown to be effective in Europe. The spread of the hypovirus is directly linked to the vegetative compatibility types (VCType) of the fungal populations, so there is a need to study the population structure of C. parasitica and identify the VCTypes present in each subpopulation. The incidence of Chestnut Blight was assessed in three chestnut groves in the Minho region, and the C. parasitica isolates obtained were further characterized. Each isolate was allocated to a VCType by matching with reference isolates, and the genetic variability of selected isolates was evaluated by BOX-PCR. The isolates obtained were functionally diverse comprising over five VCType, with EU-11 (62%), followed by EU-2 (20%), EU-1 e EU- 66 (5, 5%) and EU-12 (7%). Banding patterns obtained by box-PCR fingerprinting did not reflect geographical origin or the VCType of the isolate

Characterization of chestnut bark fungal communities in healthy trees and blight recovered through natural or introduced hypovirulence

Various fungal species together with Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr. have been isolated from chestnut tissues with blight symptoms. Microfungi remain in cankers during tissue healing, which occurs by transmitting hypovirulence by Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) compatible strains. However, studies focused on the diversity and ecology of the non-C. parasitica taxa on chestnut bark are lacking. This work evaluated the composition and richness of microfungi species associated with healthy chestnut trees, those with cankers healed by natural hypovirulence and those treated with hypovirulent strains (artificially introduced hypovirulence). Microfungi from diseased trees were isolated from six randomly selected points in the inner and external areas of the healed canker. In healthy trees, tissue samples were collected from 12 random locations on each tree’s trunk. Fungal species were identified based on morphological characteristics and ITS region sequencing using the universal primers ITS1 and ITS4. Four hundred thirty-one fungal isolates were obtained from which 38 operational taxonomic units (OTUs) were identified. The fungal communities varied from tree to tree and did not display similar patterns. The endophyte Biscogniauxia mediterranea and epiphyte Cytospora eucalypticola fungi were detected in all study locations and tree health conditions. Notably, C. parasitica (virulent and hypovirulent strains) was dominant in the inner area of healed cankers, accounting for 64.3% of the isolates, and the saprobe fungi Penicillium glabrum was dominant among non-C. parasitica microfungi species. Dissimilarity analyses showed low similarity between the microfungi communities found in the inner and external areas of the healed cankers. The study reveals the long-life span of C. parasitica in healed cankers and the therapeutic effect of natural and introduced hypovirulence.This study was funded by the Project BioChestnut PDR2020-101-030959info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Virulencia, enzimas ligninolíticas y perfil metabólico de cryphonectria parasitica en cepas virulentas e hypovirulentas convertidas por CHV1 hipovirus

Cryphonectria parasitica, fungo responsável pelo cancro do castanheiro, causa lesões necróticas (cancros corticais) no tronco e ramos das árvores hospedeiras. O hipovírus, Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) reduz a virulência (hipovirulência) e altera a morfologia do fungo em cultura (redução da pigmentação e esporulação). As estirpes hipovirulentas CHV1 são utilizadas com sucesso na Europa como agentes de controlo biológico do Cancro do castanheiro. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi compreender o efeito do hipovírus na virulência e metabolismo do fungo, comparando a produção de algumas enzimas lenhinolíticas e os perfis metabólicos de estirpes virulentas e estirpes isogénicas de C. parasitica convertidas (com CHV1). Métodos: A virulência de cada isolado foi avaliada por inoculação de micélio do fungo em maçãs (cv. Golden Delicious) e em ramos destacados de castanheiro com um ano de crescimento. Para a deteção da atividade de enzimas lenhinolíticas (lacases, peroxidases e celulases) foram usados vários substratos e compostos indicadores. O perfil metabólico de C. parasitica foi avaliado pelo sistema Biolog FF microplates pela utilização de 95 fontes diferentes de carbono. Resultados: A utilização de MicroPlacas FF (Biolog, Inc.) indicaram que a utilização de 95 fontes de carbono pelos cinco isolados de C. parasitica, foram significativamente diferentes (p <0,001), quando os substratos foram agrupados em seis tipos de compostos químicos. Os maiores valores de AWCD foram obtidos para os hidratos de carbono, ácidos carboxílicos e polímeros, e os menores valores para os grupos aminas / amidas, aminoácidos e compostos diversos. Conclusões: A avaliação da virulência de isolados de C. parasitica é importante para o estudo dos processos de hipovirulência mediados pelo hipovírus CHV1. Os ramos destacados de castanheiro foram, em nosso estudo, mais adequados que o teste em maçã para diferenciar as estirpes hipovirulentas das virulentas de C. parasitica. Os isolados virulentos evidenciaram sempre uma maior atividade de lacase induzida por ácido tânico (Lac3) e de outras enzimas lenhinolíticas (LiP, MnP e celulase) quando comparadas com os hipovirulentos. Os resultados da análise dos perfis metabólicos mostram que alguns grupos de substratos foram mais consumidos por isolados hipovirulentos. Estes estudos abrem novas perspetivas para entender o processo biológico usado pelo hipovírus, e sugerem que este é um método para discriminar estirpes hipovirulentas, e estudar a ecologia e a aptidão em campo destes isolados do fungo.Cryphonectria parasitica, the causal agent of chestnut blight, causes necrotic lesions (so-called cankers) on the bark of stems and branches of susceptible host trees. Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) infects C. parasitica and reduces the fungus virulence (hypovirulence) and alters the fungus morphology in culture (pigmentation and sporulation capacity). By these characteristics, the strains with hypovirus CHV1 are used in Europe as a biological control agent of chestnut blight. Objectives: The aim of this work is to understand the effect of hypovirus on fungi virulence by comparing the production of some lignin-degrading enzymes and the metabolic profiles of some isogenic virulent and hypovirulent (converted and original) strains. Methods: The virulence of each strain was evaluated by mycelial inoculation on apple fruits (cv. Golden Delicious) and on detached, one year old, chestnut branches. To detect the activity of ligninolytic enzymes (laccases, peroxidases and cellulases), various substrates and indicator compounds were used. The metabolic profile of C. parasitica was evaluated by the Biolog FF system using 95 different carbon sources. Results: Virulent strains were found to cause more significant necrotic lesions in chestnut branches (p<0.05) and to produce larger lignin-degrading enzymes. The use of Biolog FF MicroPlates indicated that the use of 95 carbon sources five isolates of C. parasitica were significantly different (p <0.001), when the substrates were grouped into six types of chemical compounds. The highest AWCD values were obtained for carbohydrates, carboxylic acids and polymers, and the lowest values for amines/amides, amino acids and miscellaneous. Conclusions: Virulence evaluation of C. parasitica strains is important to study the hypovirulence processes mediated by the hypovirus CHV1. The detached branches of chestnut were, in our study, more suitable than apple fruits test in discriminating hypovirulent from virulent strains of C. parasitica. Virulent strains showed higher activity of acid-tannic inducible laccase (Lac3) and other lignin-degrading enzymes (LiP, MnP, and cellulase) when compared with hypovirulent ones. The results of the metabolic profiles studies may lead to new perspectives for understanding the biological process used by the hypovirus therefore, this may suggest a method for discriminating hypovirulent strains and study ecology and field fitness in this fungal strains.Cryphonectria parasitica, el agente causal del Chancro del castaño, causa lesiones con necrosis (chancros corticales) en la corteza de los troncos y ramas de los árboles de hospedadores susceptibles. Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) y reduce la virulencia (hipovirulencia) con alteración de la morfología del hongo en cultivo (pigmentación y capacidad de esporulación). Por estas características, el micovirus CHV1 se usa en Europa como agente de control biológico del Chancro del castaño. Objetivos: El objetivo de este proyecto es comprender el efecto del hipovirus en la virulencia del hongo mediante la comparación de la producción de algunas enzimas ligninolíticas y de los perfiles metabólicos de algunas cepas virulentas e hipovirulentas (convertidas y originales). Métodos: La virulencia de cada aislado se evaluó inoculando el micelio del hongo en manzanas (cv. Golden Delicious) y en ramas separadas de castaño con un año de crecimiento. Para la detección de la actividad de las enzimas ligninolíticas (lacasas, peroxidasas y celulasas) se utilizaron varios sustratos y compuestos indicadores. El perfil metabólico de C. parasitica fue evaluado por el sistema Biolog FF utilizando 95 fuentes de carbono distintas. Resultados: Se constató que las cepas virulentas causan lesiones significativamente más grandes en las ramas de castaño (p < 0,05) y producen más enzimas ligninolíticas. El uso de Biolog FF MicroPlates indicaron que el uso de 95 fuentes de carbono por los cinco aislados de C. parasitica eran significativamente diferentes (p <0.001), cuando los sustratos se agruparon en seis tipos de compuestos químicos. Los valores más altos de AWCD se obtuvieron para carbohidratos, ácidos carboxílicos y polímeros, y los valores más bajos para las aminas /amidas, aminoácidos y compuestos diversos. Conclusiones: La evaluación de la virulencia de las cepas de C. parasitica es importante para estudiar los procesos de hipovirulencia mediados por el hipovirus CHV1. Las ramas de castaño fueron, en nuestro estudio, más adecuadas que las manzanas para discriminar cepas hipovirulentas y virulentas de C. parasitica. Los aislados virulentos mostraron una mayor actividad de lacasa inducible por ácido tánico (Lac3) y otras enzimas ligninolíticas (LiP, MnP y celulasa) en comparación con los hipovirulentos. Los resultados de los perfiles metabólicos obtenidos muestran que algunos grupos químicos de sustratos fueron más consumidos por cepas hipovirulentas. Estos estudios pueden conducir a nuevas perspectivas para entender el proceso biológico utilizado por el hipovirus, por lo tanto, esto puede sugerir que este es un método para discriminar cepas hipovirlulentas y para estudiar la ecología y la aptitud de campo de estas cepas de hongos.This work supported by the project PDR2020-101-030959 - “BioChestnut- IPM - Implementar estratégias de luta eficazes contra doenças do castanheiro e amendoeira”.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Natural spread of hypovirulence in Cryphonectria parasitica. A case study, Sergude - Minho – Portugal

El castaño (Castanea sativa) es una especie de gran importancia económica y social en la región del Norte de Portugal. Uno de los mayores obstáculos en el aumento de la producción de castaña está relacionada con la presencia de factores bióticos como la antigua y conocida enfermedad de la Tinta y más recientemente con el chancro que provoca elevada mortalidad en los castaños. No hay sustancias químicas capaces de bloquear el desarrollo del chancro del castaño y todos los medios de lucha cultural mostraron baja eficacia. La hipovirulencia es el medio de lucha biológica y la manera más ventajosa para parar la enfermedad en Europa. El método mostro una elevada capacidad de cura en los chancros y la recuperación completa de los castaños atacados. El mecanismo molecular de hipovirulencia está asociado a la presencia en el hongo parasítico del virus dsRNA denominado Hypovirus (CHV). En Sergude (Minho) en una parcela con todos los árboles atacados por C. parasitica se verifico en un periodo de 3 – 4 años la remisión natural de los chancros llevando a la recuperación de los árboles enfermos. Conocer los mecanismos implicados en la expresión de la hipovirulencia y los factores asociados a su dispersión natural fue el objeto de este trabajo. Se estudió la estructura poblacional de C. parasitica presente en la parcela así como la micoflora epifítica y endofítica asociada.Chestnut (Castanea sativa) is a species of great economic and social importance in the Northern region of Portugal. One of the biggest barriers to increased nut production is related to the presence of biotic factors such as the old and familiar Ink Disease and more recently the Chestnut Blight that is causing high mortality in chestnut. In the absence of chemical fungicides capable of stopping the development of the Chestnut Blight and considering the reduced effectiveness of other mitigation measures, hypovirulence is the most advantageous way to control the disease in Europe. The method showed high ability to heal the cankers and promote the complete recovery of chestnut. The molecular mechanism of hypovirulence is associated with the presence of dsRNA virus of the genus Hypovirus. In Sergude (Minho) in a chestnut grove with all trees attacked by C. parasitica in a period of 3-4 years occurred the natural remission of cankers leading to the recovery of diseased trees. Our objective was to understand the mechanisms involved in the expression of hypovirulence and factors associated with its natural dispersion . We studied the population structure of C. parasitica present in chestnut and associated epiphytic and endophytic mycoflor

Cooperation for Innovation in the European Union: Outlook and Evidences Using CIS for 15 European Countries

Cooperation for innovation is understood as an essential element in the innovation process of European firms. The aim is to compare how the different sources of information (external and internal) and cooperation for innovation are used in manufacturing and services in Europe using Community Innovation Survey (CIS) data for 15 European countries. The empirical study uses a sample of firms included in the CIS (2008), which covers 15 European countries and applies multivarious data analysis techniques to extract results. The results of this research suggest that firms use simultaneously different sources of information for cooperation, revealing different patterns of cooperation according to the activity sector in Europe. This paper brings some important insights about cooperation for innovation and suggests some patterns in Europe useful to design public policies, due de similar behavior of some countries grouped according with geography, development status or other economic features. Thus, this article seeks to frame the subject based on a literature review that raises a set of study hypotheses and presents an empirical study applied to cooperation for innovation in Europe using the CIS for 15 European countries.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Manual de boas práticas para o tratamento biológico do cancro do castanheiro (Cryphonectria parasitica) em Portugal

O cancro do castanheiro é uma doença associada ao fungo Cryphonectria parasitica (Murril) Barr, espécie de origem asiática, invasora e muito agressiva em castanheiro que provoca a morte dos ramos e progressivamente de toda a árvore. A European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) categoriza o fungo C. parasitica como um organismo de quarentena da lista A2 ou seja, um organismo de quarentena mas já presente em muitos dos países da Europa (EPPO, 2022). A doença foi introduzida na Itália em 1938 e está presente em Portugal, com carater epidémico desde 1989 (Abreu, 1992). Nos finais dos anos 90 a doença estava já presente em toda a área de castanheiro com uma taxa média de 10 % de árvores infetadas (Gouveia et al., 2001). A taxa de infeção é muito variável existindo locais com valores de 28,5 % de castanheiros doentes enquanto em outros locais a taxa de infeção é reduzida (1,8 %) ou não estava ainda presente. O desenvolvimento epidémico continuou e, em pouco tempo, atingiu em alguns locais valores de incidência superiores a 40% (Bragança, 2007). As medidas de quarentena e legislativas (então obrigatórias uma vez que a EU categorizava o fungo como organismo de quarentena), evidenciaram pouca eficácia e não evitaram a dispersão e avanço da doença. Para controlar a doença não existem meios de luta eficazes e não estão disponíveis castanheiros resistentes à doença. A luta biológica com utilização de estirpes hipovirulentas de C. parasitica (hipovirulência) é um meio de luta muito eficaz que promove a cicatrização dos cancros e a total recuperação dos castanheiros doentes e considerado pela EFSA (2016) como o meio mais adequando e mais eficaz para mitigar e controlar os elevados riscos que a doença coloca em termos económicos, sociais e ecológicos. A luta biológica é uma estratégia de proteção das plantas que se baseia no conhecimento aprofundado do parasita, do hospedeiro e do ecossistema, e cujo objetivo é restabelecer o equilíbrio natural e evitar os elevados prejuízos ambientais e económicos. A hipovirulência é um meio de luta biológico que ocorre de forma natural na natureza mediado por processos biológicos e moleculares complexos que envolve o fungo parasita (C. parasitica), o agente de controlo biológico - o vírus (Cryponectria hypovirus 1 - CHV1) que se multiplica exclusivamente no interior do fungo, o castanheiro (Castanea sativa) e ainda as muitas condições ambientais que determinam todo o processo. Atualmente o tratamento do cancro do castanheiro em Portugal baseia-se preferencialmente na aplicação da luta biológica com base em estirpes hipovirulentas de C. parasitica seguindo o estipulado no “Programa Experimental para o Tratamento Biológico do Cancro do Castanheiro com Base em Estirpes Hipovirulentas de Cryphonectria parastica - Estirpes CHV1” autorizado pela entidade nacional competente (DGAV - Ministério da Agricultura). É objetivo deste Manual de Boas Práticas para o Tratamento Biológico do Cancro do Castanheiro (Cryphonectria parasitica) em Portugal comunicar e divulgar o novo método de tratamento do cancro do castanheiro baseado na utilização de estirpes hipovirulentas de C. parasitica (Estirpes CHV1). Pretende-se ainda contribuir para a compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos no processo de recuperação das árvores e clarificar e elucidar o contexto da sua aplicação prática nos soutos para que as potencialidades do método sejam atingidas e assim se recupere a vitalidade e resiliência do ecossistema castanheiro. O Manual de Boas Práticas destina-se a um conjunto alargado de utilizadores dos quais se destacam os produtores de castanheiro e técnicos agrícolas e florestais especializados e para todos os interessados em proteção vegetal em especial nos novos métodos e novas estratégias no tratamento das doenças das plantas. O manual foi concebido para proporcionar a compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos no processo de recuperação dos castanheiros e apresentar de forma integrada a atuação dos diferentes intervenientes em formato esquematizado com as diferentes etapas, objetivos e ações para uma aplicação informada da luta biológica no tratamento do cancro do castanheiro. Foram ainda incluídos de forma mais aprofundada e complementar em formato “caixa” os fundamentos científicos dos mecanismos biológicos que determinam a eficácia do método.BioChestnut- IPM - Implementar estratégias de luta eficazes contra doenças do castanheiro e amendoeira - PDR2020-1.0.1-030943info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Re-evaluation of the spectroscopic data and redox properties

Eur. J. Biochem. 270, 3904–3915 (2003)The cytochrome c nitrite reductase is isolated from the membranes of the sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 as a heterooligomeric complex composed by two subunits (61 kDa and 19 kDa) containing c-type hemes, encoded by the genes nrfA and nrfH,respectively. The extracted complex has in average a 2NrfA:1NrfH composition. The separation of ccNiR subunits from one another is accomplished by gel filtration chromatography in the presence of SDS. The amino-acid sequence and biochemical subunits characterization show that NrfA contains five hemes and NrfH four hemes. These considerations enabled the revision of a vast amount of existing spectroscopic data on the NrfHA complex that was not originally well interpreted due to the lackof knowledge on the heme content and the oligomeric enzyme status. Based on EPRandMo¨ ssbauer parameters and their correlation to structural information recently obtained from X-ray crystallography on the NrfA structure [Cunha, C.A., Macieira, S., Dias, J.M., Almeida, M.G., Gonçalves, L.M.L., Costa, C., Lampreia, J.,Huber,R., Moura, J.J.G., Moura, I. & Romão, M. (2003) J. Biol. Chem. 278, 17455– 17465], we propose the full assignment of midpoint reduction potentials values to the individual hemes.NrfAcontains the high-spin catalytic site ()80mV) as well as a quite unusual high reduction potential (+150 mV)/low-spin bis-His coordinated heme, considered to be the site where electrons enter. In addition, the reassessment of the spectroscopic data allowed the first partial spectroscopic characterization of theNrfH subunit. The four NrfH hemes are all in a low-spin state (S ¼ 1/2).One of them has a gmax at 3.55, characteristic of bis-histidinyl iron ligands in a noncoplanar arrangement, and has a positive reduction potential

Biosensor for direct bioelectrocatalysis detection of nitric oxide using nitric oxide reductase incorporated in carboxylated single-walled carbon nanotubes/lipidic 3 bilayer nanocomposite

An enzymatic biosensor based on nitric oxide reductase (NOR; purified from Marinobacter hydrocarbonoclasticus) was developed for nitric oxide (NO) detection. The biosensor was prepared by deposition onto a pyrolytic graphite electrode (PGE) of a nanocomposite constituted by carboxylated single-walled carbon nanotubes (SWCNTs), a lipidic bilayer [1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylene glycol (DSPE-PEG)] and NOR. NOR direct electron transfer and NO bioelectrocatalysis were characterized by several electrochemical techniques. The biosensor development was also followed by scanning electron microscopy and Fourier transform infrared spectroscopy. Improved enzyme stability and electron transfer (1.96 × 10-4 cm.s-1 apparent rate constant) was obtained with the optimum SWCNTs/(DOPE:DOTAP:DSPE-PEG)/NOR) ratio of 4/2.5/4 (v/v/v), which biomimicked the NOR environment. The PGE/[SWCNTs/(DOPE:DOTAP:DSPE-PEG)/NOR] biosensor exhibited a low Michaelis-Menten constant (4.3 μM), wide linear range (0.44-9.09 μM), low detection limit (0.13 μM), high repeatability (4.1% RSD), reproducibility (7.0% RSD), and stability (ca. 5 weeks). Selectivity tests towards L-arginine, ascorbic acid, sodium nitrate, sodium nitrite and glucose showed that these compounds did not significantly interfere in NO biosensing (91.0 ± 9.3%-98.4 ± 5.3% recoveries). The proposed biosensor, by incorporating the benefits of biomimetic features of the phospholipid bilayer with SWCNT's inherent properties and NOR bioelectrocatalytic activity and selectivity, is a promising tool for NO.FG thanks to Fundacão para a Ciência e a Tecnologia, MCTES (FCT/MCTES) for the fellowship grant SFRH/BD/52502/2014, which is financed by national funds and co-financed by FSE. LBM thanks to FCT/MCTES for the CEEC-Individual 2017 Program Contract. This work was supported by the PTDC/BB-BQB/0129/2014 project (FCT/MCTES), by FCT/MEC with national funds and co-funded by FEDER, and also by the Associate Laboratory Research Unit for Green Chemistry - Technologies and Processes Clean – LAQV, financed by national funds from FCT/MCTES (UID/QUI/50006/2019). The financial support from the European Union (FEDER funds through COMPETE) and National Funds (Fundação para a Ciência e Tecnologia-FCT) through project PTDC/ASP-PES/29547/2017, by FCT/MEC with national funds and co-funded by FEDER, is also acknowledged. J.A. Loureiro post-doc grant was supported by NORTE-01-0145-FEDER-000005 – LEPABE-2 ECO-INNOVATION, from North Portugal Regional Operational Program (NORTE 2020), under the Portugal 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Química Bioinorgânica e luz - fotossíntese, oxigénio e água

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