Interacciones entre la Galanina (1-15) y los receptores Serotoninérgicos 5HT1A en el Sistema Nervioso Central: Implicación en la depresión

La Galanina (GAL) es un neuropéptido ampliamente distribuido en el Sistema Nervioso Central (SNC), que presenta un fragmento N-terminal de 15 aminoácidos común en todos los mamíferos. La GAL participa en diversas funciones, destacando más su implicación en la depresión. El fragmento N-terminal de GAL 1-15 [GAL(1-15)] posee actividad biológica en el SNC, y además presenta un papel diferencial de la molécula completa de GAL, como en el Control Central Cardiovascular. Los tres subtipos de receptores de GAL (GALR1, GALR2 y GALR3) tienen una mayor afinidad por la molécula de GAL que por la GAL(1-15), sin embargo existen lugares de unión específicos para la GAL(1-15) como es el caso del Hipocampo dorsal y el núcleo del Rafe dorsal, áreas implicadas en la depresión. Estudios recientes han propuesto, que el mecanismo de acción del fragmento GAL(1-15) podría ser a través de un Heterodímero formado por los receptores GALR1/GALR2. La GAL y la Serotonina (5HT) colocalizan en distintos núcleos, destacando el Rafe dorsal, núcleo de gran importancia en la patofisiología de la depresión, además se ha descrito una interacción antagónica entre la GAL y los receptores 5HT1A, tanto a nivel de receptor en preparaciones de membranas límbicas y a nivel del Rafe dorsal como en estudios de conducta animal, en el test de evitación pasiva. Estas interacciones antagónicas se explicarían mediante la existencia de Heterodímeros entre los receptores de GAL y el receptor 5HT1A. Recientemente nuestro grupo de investigación ha demostrado la existencia de heterodímeros GALR1/5HT1A, y además se ha sugerido la existencia de mosaicos de receptores GALR1/GALR2/5HT1A. Por ello el objetivo de este trabajo ha sido analizar la función de la GAL(1-15) en pruebas de comportamiento animal relacionadas con la depresión y ansiedad, así como describir el posible mecanismo de actuación de este fragmento de GAL en el SNC. Además se ha estudiado la modulación de la GAL(1-15) sobre los receptores 5HT1A en pruebas de conducta animal de depresión analizando los mecanismos implicados en dicha interacción. Los resultados de la presente tesis demuestran que la GAL(1-15) presenta un fuerte efecto prodepresivo y ansiogénico en las pruebas de conducta empleadas, que además resulta más potente que el generado por la GAL. Hemos demostrado la implicación del receptor GALR2 en este efecto mediante el uso de antagonistas específicos y animales Knockdown GALR2. La técnica de ligazón por proximidad nos muestra la existencia de posibles complejos heterodímeros GALR1/GALR2 en el hipocampo dorsal y especialmente en el Rafe dorsal, estos complejos GALR1/GALR2 se redujeron notablemente en el hipocampo dorsal y de una forma más intensa en el Rafe dorsal en animales Knockdown GALR2, desapareciendo además los efectos comportamentales de la GAL(1-15) en estos animales. Además, la GAL(1-15) presenta un patrón de internalización diferente a la GAL en células HEK293 que coexpresan los receptores GALR1 y GALR2, siendo principalmente la GAL(1-15) quien induce la internalización de los receptores en estas células. En células derivadas del núcleo del Rafe RN33B, GAL(1-15) produce una disminución de la inmunorrecatividad de la 5HT y C-Fos de una forma más potente que la GAL. Estos resultados sugieren que la GAL(1-15) participa en los mecanismos de control de la ansiedad y depresión disminuyendo la actividad celular y síntesis y almacenamiento de 5HT en el Rafe dorsal, este efecto podría estar realizado a través del heterodímero GALR1-GALR2. En esta tesis también se ha estudiado la interacción entre la GAL(1-15) y los receptores 5HT1A, demostrándose una potenciación de la acción antidepresiva del agonista 5HT1A. Este efecto se bloquea con antagonistas GALR2, demostrando así la implicación de este receptor en la interacción. Esta interacción se observa también a nivel de receptor ya que GAL(1-15) modula las características y la expresión de los receptores 5HT1A, disminuyendo los sitios de unión del 5HT1A en el rafe dorsal y aumentándolos en el hipocampo dorsal. Hemos observado que los receptores GALR1/5HT1A y GALR2/5HT1A se encuentran a una distancia que permite la interacción física entre ellos en estas zonas. En células derivadas del Rafe RN33B la GAL(1-15) inducía una reducción de la expresión del 5HT1A de una más potente que la GAL. Por tanto, estos resultados sugieren la existencia de una interacción entre GAL(1-15) y el 5HT1A en el hipocampo dorsal y el Rafe dorsal que sería responsable de la potenciación del efecto antidepresivo del agonista 5HT1A inducido por GAL(1-15). El mecanismo molecular de esta interacción podría implicar la formación de mosaicos de receptores GALR1/GALR2/5HT1A

Galanin N-terminal fragment (1-15) reduces alcohol consumption in the self-administration with involvement of mesocorticolimbic system in rats.

Alcohol Use Disorder (AUD) is a highly prevalent disorder characterized by an impaired ability tostop or control alcohol use despite the adverse consequences. Nowadays, AUD treatment is limiteddue to the low efficacy of the medication. Our research group discovered that GAL(1–15) induces asubstantial reduction in preference and voluntary alcohol consumption in rats. To investigate therole of GAL(1-15) in alcohol seeking-behaviour, we used the self-administration in rats. Also, weanalyzed the mesocorticolimbic system on the mRNA expression. Male Sprague-Dawley rats (n=6-15 animals in each group) were trained to self-administer 10%alcohol under fixed-ratio FR1 in the self-administration boxes. GAL(1-15) or vehicle wereadministered intracerebroventricular 15 min before the test. A dose-response of GAL(1-15) at doses0.3, 1 and 3nmol was performed in the alcohol self-administration test. GALR1 and GALR2 wereanalyzed with GALR2 antagonist M871 and using an in vivo model siRNA GALR1 or GALR2knockdown rats. We analyzed mRNA expression of C-Fos in the ventral tegmental area (VTA),accumbens nucleus (NAc) and prefrontal cortex (PFC). One-way ANOVA followed by Fisher´s leastsignificant difference test was used. GAL(1-15) 3nmol reduced the number of reinforcements and the active lever (p<0.01) comparedwith control animals. GAL(1-15) 1nmol induced a less strong but significant reduction in thisparameters.The M871 3nmol blocked the GAL(1-15)-induced reduction in the number ofreinforcements and in the number of active lever (p<0.05). Downregulation of GALR1 or GALR2 bysiRNA was sufficient to block GAL(1-15) effects in this test.GAL(1-15) 3nmol increased mRNA C-Foslevels in VTA (p<0.01), NAc (p<0.05) and PFC(p<0.05) compared with control group. Our results indicate that GAL(1-15) induces a strong reduction of alcohol-seeking behaviour withthe involvement of the mesocorticolimbic pathway and open up the possibility of using GAL(1-15)fragment as a novel pharmacological strategy in AUDUniversidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Galanin (1-15) increased the neuropétide-Y Y1 receptor bindng in the amygdala of the rats

Galanin (GAL) and N-terminal Galanin fragment (1-15) [GAL(1-15)] interact at membrane level with Neuropeptide Y receptors. In the nucleus of the solitary tract GAL modified the cardiovascular action of the NPYY1 and GAL(1-15) facilitated the NPYY2 agonist effect. Recently, we observed that in the amygdala, GAL increased the anxiolytic effect and the binding of the NPYY1 agonist. The aim of this work was to study if GAL(1-15) interacts as well with NPYY1 receptors in the amygdala. We analyzed the binding of the NPYY1 agonist [125I]-Leu31-Pro34-PPY (25pM) in the presence of GAL(1-15) at different doses. The GAL antagonist M40 was also used. In behavioural experiments, groups of rats (n=8-10) received intracerebroventricular GAL(1- 15)(1nM) and Leu31-Pro34-NPY (0.1nM or 3nM) alone or in combination fifteen minutes before starting 5-minute session in the open field (OF) and in the elevated plus maze (EPM). We analyzed the number of entries and time in the central square of OF and the percentages of entries and time in the open arms of EPM. GAL(1-15) at 1nM increased the NPYY1 agonist binding by 10% (p<00.1) in amygdala, M40 blocked this effect. In the behavioral tests, GAL(1-15) did not change the effect of NPYY1 in the OF or EPM. These results indicate that in the amygdala, GAL(1-15) interacts with NPYY1 receptor at membrane level but not in the unconditioned anxiety-like tests. These results may be of relevance for GAL(1-15) mediated actions in the central nervous system.This work has been supported by the Junta de Andalucia CVI6476.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

GALR2/NPYY1R heterodimers interact at receptor level in the dentate gyrus of the hippocampus in rats

Previously, we have described Galanin(GAL) and Neuropeptide Y Y1(NPYY1) interactions at behavioural, cellular and receptor levels through GALR2/NPYY1R heterodimers in the amygdala. The aim of this work was to study GAL/NPYY1R interactions in the Dentate Gyrus (DG) of the Hippocampus, using autoradiographic, in situ hybridization and in situ proximity ligation assay (PLA). Rats (n=6) were sacrificed 15 minutes or 5 hours after icv injections of GAL (3nmol) and DG sections were incubated with NPYY1R agonist [I125]-[Leu31,Pro34]PYY (25 pM) or NPYY1R-33PdATP specific probe, for autoradiography and in situ hybridization respectively. Autoradiograms were analyzed using NIH image analysis system and Student’s unpaired t-test was used. For PLA, DG sections were incubated with anti-GALR2 Rabbit (1:100) and anti-NPYY1R Goat (1:200). PLA signals were detected with PLA PLUS or MINUS probes for rabbit or goat/mouse antibodies. PLA signals were visualized by using a confocal microscope Leica TCS-SL confocal microscope (Leica). We observed that GAL significant increased the NPYY1R agonist [I125]-[Leu31,Pro34]PYY binding in the DG by 20% (p<0,05) and the NPYY1R mRNA expression in the granular layer of DG by 31% (p<0,001). Moreover, PLA-positive red clusters were found specifically in the polymorphic layer and subgranular zone of the DG. No PLA clusters were observed neither in the molecular layer of the DG nor in the corpus callosum, an area that seems to lack of GALR2 receptor. These results demonstrate a novel mechanism of interaction between GAL and NPY1R in the DG at receptor level, probably involving the formation of GALR2/NPYY1R heteroreceptor complexes. Study supported by Junta de Andalucia CVI6476.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Study supported by Junta de Andalucia CVI6476

Galanin (1-15) enhances the effects of Fluoxetine in an animal model of depression. Role of the 5-HT1A receptor.

Major depression is one of the most significant contributors to global disability. Selective serotoninergicreuptake inhibitors, including Fluoxetine (FLX), are the most commonly used antidepressant but are onlyeffective in 50% of patients. In recent studies, we observed that the N-terminal fragment of Galanin [GAL(1-15)]enhanced the antidepressant effects of FLX in naïve rodents. In this study, we analyzed the effect of GAL(1-15) in combination with FLX in an animal model of depression,the olfactory bulbectomy (OBX) rat, in the forced swimming test (FST) and the sucrose preference test (SPT)tests, related with despair and anhedonic behaviors. We also studied the role of the hippocampal 5-HT1AR inGAL(1-15)-enhancing effects using quantitative autoradiographic techniques. Groups of rats (n=7-9) received a subchronic pattern of FLX(10mg/Kg) alone or in combination with GAL(1-15)(1nmol) 15 min before the tests. Then, brains were removed, and coronal sections were obtained at the dorsalhippocampus. Saturation experiments were performed using [3H]-8-OH-DPAT. One-way ANOVA followed byFisher ́ s least significant difference test was used. Our results show that GAL(1-15)+FLX induced a decrease in the immobility time (p<0.05) and an increase inswimming by 30% (p<0.01) compared with FLX in the FST. In the SPT, only the combination of GAL(1-15)+FLXcould reverse the anhedonic behavior of OBX rats, increasing the sucrose intake (p<0.05) and preference(p<0.05). The combination of GAL(1-15)+FLX decreases the Kd and increases the Bmax value of 5-HT1A (p<0,05) in DGcompared with FLX in OBX animals. In conclusion, combining GAL(1-15)+FLX suggests a new augmentation strategy for treating depression.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

The combination of Galanin (1-15) and Escitalopram decrease the alcohol selfadministration in rats through the functional network ventral tegmental area – dorsal raphe.

Alcohol Use Disorder AUD is a highly prevalent, and most AUD patients suffer comorbidity with depression. To investigate the effect of GAL(1-15) on ESCmediated effect in depression-alcoholism comorbidity, we used the alcohol self-administration test. In addition, to study the circuits involved, we analyzed the immuno of C-Fos in several nuclei implicated in reward-seeking behaviour and we assessed the brain circuits using principal component analysis (PCA) to understand brain functional organization. Male Sprague-Dawley rats received three intraperitoneal injections of ESC(2.5mg/Kg) 23, 5 and 1h and icv injection of GAL(1-15)(0.3nmol) 15' before the alcohol self-administration test. The brain was removed 90' after the icv injection toanalyzed C-Fos in several nuclei involved in depression and AUD: dorsal raphe (DR), rostromedial tegmental nucleus (RMTg), lateral habenula (LHb), medial habenula (mHb), ventral tegmental area (VTA), nucleus accumbens (NAc) and prefrontal cortex (CPF). ANOVA followed by Fisher´s least significant di"erence test was used. In the alcohol self-administration test, the combination of GAL(1-15)(0,3nmol) and ESC(2,5mg/Kg) decreased the number of alcohol reinforcements and the number of active lever. GAL(1-15)+ESC coadministration significantly decreased C-Fos expression in the VTA compared with control group but no significative effects were observed in the rest of the nuclei. However, PCA analysis revealed three independent factor representing the functional brain modules. The main factor was DR, VTA and RMTg. The results indicate a functional network involved in GAL(1-15)+ESC alcohol self-administration effects. It opens up the possibility to use GAL(1-15)+ESC as a novel strategy in AUD comorbidity with depression.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

NPYY1 /Galanin 2 heterodimers in the amygdala: a proximity ligation assay study

We have shown that Galanin(GAL) interacts with Neuropeptide Y Y1 receptor(Y1) at behavioural, cellular and receptor levels in the Amygdala. Since both peptides play an important role in mood disorders, the aim of this work was to study the GALR2/Y1 heterodimer formation within the amygdala(AMY), key nucleus for fear, mood, and motivation. We performed in situ proximity ligation assay(PLA) in the Amygdala and also in HEK-293 cells. Amygdala sections were incubated with anti-GALR2 Rabbit(1:100) and anti- NPYY1R Goat(1:200). In transiently transfected HEK293T cells coexpressing Y1R(3xHA) and GALR2 mouse anti-HA(1:5000) and rabbit anti-GALR2(1:500) were used. In both cases PLA signals were detected with PLA PLUS or MINUS probes for rabbit or goat/mouse antibodies. PLA signals were visualized by using a confocal microscope Leica TCS-SL confocal microscope(Leica). PLA-positive red clusters were found in large number of cells of the Basolateral, Intercalated and Central nuclei of the Amygdala. No PLA clusters were observed in lateral corpus callosum, an area that seems to lack of GALR2 receptor. In HEK293T cells we reproduced the results obtained in the Amygdala, showing PLA-positive red clusters in large number of cells. The fact that we found PLA-positive red clusters in a large number of cells not only in the Amygdala but also in the HEK293T cells line give indications that GALR2 and NPYY1R are forming GALR2/NPYY1R heterodimers, providing a novel mechanism with implications in behavior, particularly in the anxiety response.Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Spanish CVI647

Estrategias aplicadas para mejorar la evaluación de la competencia de trabajo en grupo

Con la implantación del EEES el aprendizaje debe estar basado en el desarrollo de competencias. La retroalimentación durante el proceso, que conlleva la posibilidad de mejora, la autoevaluación y la coevaluación de compañeros, así como la reflexión, son elementos que promueven el desarrollo de competencias. En este trabajo se plantea una propuesta práctica para la planificación de la evaluación desde la perspectiva de la competencia de trabajo cooperativo y una reflexión de las implicaciones que este enfoque tiene en la carga de trabajo en el profesorado universitario. En este contexto, en dos asignaturas de la Licenciatura de Ciencias Ambientales que se imparten en la Universidad de Málaga, se han desarrollado actividades en la docencia práctica de las asignaturas. Estas actividades llevan intrínsecamente asociadas el desarrollo de otras competencias transversales, además del trabajo en grupo, como por ejemplo la búsqueda y selección de información.SIN FINANCIACIÓNNo data 201

Evaluación de competencias y aprendizaje online mediante el empleo de plantilla de registro y TICs en la docencia práctica de asignaturas de Ciencias de la Salud

En Ciencias de la Salud, las competencias adquiridas del alumno mediante el trabajo experimental realizado en las prácticas es un elemento esencial en el proceso de formación, y que constituye una parte poco significativa de la evaluación final y apenas se emplean Tecnologías de la Información y de la Comunicación (TICs). El objetivo fundamental de este trabajo ha sido diseñar e implementar una innovadora evaluación centrada en competencias en la docencia práctica. Se han analizado cuáles son las competencias de conocimientos, de habilidades y destrezas y de actitudes y valores necesarias que deberían de adquirir los alumnos en la docencia práctica. Se ha desarrollado una plantilla de registro de dichas competencias, que es cumplimentada y puntuada por el profesor. Además, se ha incorporado el uso de diversas TICs en el Campus Virtual para evaluar las demás competencias. Se ha observado como una media del 90% de los alumnos ha cumplido con las competencias necesarias en las distintas prácticas. Además, esta innovadora forma de evaluación ha supuesto una notable mejora en la nota final del alumno, a la vez que ha contribuido a su aprendizaje de manera online.SIN FINANCIACIÓNNo data 201