Activation of a nucleotide-dependent RCK domain requires binding of a cation cofactor to a conserved site

RCK domains regulate the activity of K+ channels and transporters in eukaryotic and prokaryotic organisms by responding to ions or nucleotides. The mechanisms of RCK activation by Ca2+ in the eukaryotic BK and bacterial MthK K+ channels are well understood. However, the molecular details of activation in nucleotide-dependent RCK domains are not clear. Through a functional and structural analysis of the mechanism of ATP activation in KtrA, a RCK domain from the B. subtilis KtrAB cation channel, we have found that activation by nucleotide requires binding of cations to an intra-dimer interface site in the RCK dimer. In particular, divalent cations are coordinated by the ¿-phosphates of bound-ATP, tethering the two subunits and stabilizing the active state conformation. Strikingly, the binding site residues are highly conserved in many different nucleotide-dependent RCK domains, indicating that divalent cations are a general cofactor in the regulatory mechanism of many nucleotide-dependent RCK domains.We thank access to ALBA (XALOC), ESRF (ID23-1) and Soleil (PROXIMA 1 and 2a) synchrotrons and technical support provided by the i3S scientific platform ‘Biochemical and Biophysical Technologies’ and FCUP|DQB-Lab and Services. Work was supported by Fundação Luso-Americana para o Desenvolvimento through the FLAD Life Science 2020 award entitled ‘Bacterial K+ transporters are potential antimicrobial targets: mechanisms of transport and regulation’ and by FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional funds through the COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalization (POCI), Portugal 2020, and by Portuguese funds through FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in the framework of the projects POCI-01–0145-FEDER-029863 (PTDC/BIA-BQM/29863/2017) and ‘Institute for Research and Innovation in Health Sciences’ (POCI-01–0145-FEDER-007274).’ CMT-D was supported by FCT fellowship (SFRH/BD/123761/2016) and FF was supported by FCT fellowship (SFRH/BPD/102753/2014)

Ion selectivity of the unusual K+ channel KtrAB

Bacteria constantly attempt to hold up ion gradients across their membranes to maintain their resting potential for routine cell function, while coping with sudden environmental changes. Under abrupt hyperosmotic conditions, as faced when invading a host, most bacteria restore their turgor pressure by taking up potassium ions to prevent death by plasmolysis. Here, the potassium transporter AB, or KtrAB for short, is a key player. KtrAB consists of the membrane-embedded KtrB dimer, which includes two pores organized in tandem, and a cytoplasmic, octameric KtrA ring, which regulates these two pores. The KtrB subunits alone were suggested to function as rather non-selective ion channels translocating potassium and sodium ions. The KtrA subunits confer transport velocity, K+ selectivity as well as Na+ and nucleotide dependency to the Ktr system. The nucleotide regulation by binding to KtrA is rather well characterized. In contrast, the regulatory role of Na+ remains elusive. Controversially discussed is how selective the ion translocation by KtrB is and how KtrA affects it. Although there are several functional and structural data available of KtrAB and its homolog TrkAH, the selectivity of the ion translocation was never thoroughly addressed. The functional characterization of whether KtrAB is a selective ion channel and how selectivity is achieved is in the focus of this thesis. Since selectivity is usually defined by the ion channels’ selectivity filter contained in the pore-forming domain, a particular attention was laid on the ion-translocating subunits KtrB. KtrB belongs to the superfamily of K+ transporters (SKT). Each KtrB monomer consists of four covalently attached M1-P-M2 motifs, each motif is made of two transmembrane (TM or M) helices that are connected by a pore (P) helix. The four motifs, referred to as domains D1 to D4, are arranged in a pseudo-fourfold symmetry and together form the pore for potassium ion translocation. Each pore contains two structural features thought to be involved in ion selectivity and ion gating. These are the non-canonical selectivity filter and the intramembrane loop. The selectivity filter is localized at the extracellular side of the pore and mostly shaped by the backbone carbonyl groups of the loops connecting the P and M2 helices in each domain. In KtrB, each P-loop contains only one highly conserved glycine residue instead of the classical -TVGYG- signature sequence of a K+ channel. This simple constructed selectivity filter led to the hypothesis that KtrAB would only have low ion selectivity. The intramembrane loop is formed by broken helix D3M2 and is located directly under the selectivity filter. It consists mostly of polar residues and acts as a molecular gate restricting ion fluxes. The intramembrane loop has been shown to be regulated by nucleotide binding to KtrA. Additionally, it could directly or indirectly be affected by Na+ binding. Further, the loop might even be involved in ion selectivity because it presents a physical barrier inside the pore. To address the ion selectivity of the Ktr system, first, the ion binding specificity of KtrB was investigated. Binding affinities of different cations to KtrB were determined using isothermal titration calorimetry (ITC). For this, KtrB from Vibrio alginolyticus was heterologously produced in and purified from Escherichia coli. 12 L of culture roughly yielded 4 to 8 mg of the functional KtrB dimer in detergent solution. ITC measurements were performed in two different buffers, one choline-Cl-based and one LiCl-based buffer. No differences in the affinity between Na+ (KD = 1.8 mM), K+ (KD = 2.9 mM), Rb+ (KD = 1.9 mM) or Cs+ (KD = 1.6 mM) were detected in the choline-Cl-based buffer; only Li+ did not bind. In contrast, ITC measurements in LiCl-based buffer revealed a significant preference for K+ (KD = 91 µM) over Rb+ (KD = 2.4 mM), Cs+ (KD = 1.7 mM) and particularly Na+ (for which no binding was observed). Similarly, the presence of low millimolar NaCl concentrations in the choline-Cl-based buffer led to a decreased KD value of 260 µM. Hence, small cations, which usually are present in the natural environment, seem to modulate the selectivity filter for a better binding of K+ ions providing K+ selectivity. In fact, the low binding affinities of the other ions could indicate that they do not even bind to the selectivity filter but to the cavity. However, ITC competition experiments showed that all four ions compete for the same or overlapping binding sites, with Rb+ and Cs+ even blocking K+ binding at concentrations 10-fold above their binding affinities. Importantly, at physiological NaCl concentrations of 200 mM, the apparent binding affinity for K+ to KtrB was still 3.5 mM. This suggested that Na+ can also bind to KtrB’s selectivity filter but with a comparably low binding affinity providing an unexpectedly high preference for K+ ions. ...Bakterien müssen für eine routinemäßige Zellfunktion ständig Ionengradienten über ihren Membranen aufrechterhalten, während sie durch wechselnde Umweltbedingungen fortlaufend herausgefordert werden. Beispielsweise kommt es beim Eindringen in einen Wirt meistens zu abrupten hyperosmotischen Änderungen, welche den Turgordruck bedrohen. Die meisten Bakterien stellen ihren Turgordruck wieder her, indem sie Kaliumionen aufnehmen, um den Tod durch Plasmolyse zu verhindern. Hier spielt der Kaliumtransporter AB, kurz KtrAB, eine Schlüsselrolle. Der KtrAB-Komplex besteht aus einem in die Membran eingebetteten KtrB-Dimer, welches aus zwei parallelen Poren gebildet wird und einem cytoplasmatischen, octameren KtrA-Ring der diese beiden Poren reguliert. Es wurde bisher angenommen, dass die Kanal-ähnliche KtrB-Untereinheit unselektiv Kalium- und Natriumionen translozieren kann. Nur in Anwesenheit der KtrA-Untereinheiten wurde gezeigt, dass das nun Na+ und Nukleotid abhängige Ktr-System eine höhere Transportgeschwindigkeit und K+-Selektivität aufweist. Die Regulation durch Nukleotiden-Bindung an KtrA ist gut charakterisiert. Im Gegensatz dazu ist die regulatorische Rolle von Na+ nicht endgültig geklärt. Umstritten ist ebenfalls, wie selektiv die Ionentranslokation durch KtrB ist und wie KtrA diese beeinflusst. Obwohl für KtrAB und sein Homolog, TrkAH, mehrere funktionelle und strukturelle Daten erhältlich sind, wurde die Selektivität der Ionentranslokation nie intensiv untersucht. Aus diesem Grund steht die funktionelle Charakterisierung der Selektivität von KtrAB im Mittelpunkt dieser Arbeit. Da die Selektivität in der Regel durch den in KtrB enthaltenen Selektivitätsfilter definiert wird, lag ein besonderes Augenmerk auf der Ionen-translozierenden Untereinheit KtrB. KtrB gehört zur Überfamilie der K+ Transporter (SKT). Jedes KtrB-Monomer besteht aus vier kovalent gebundenen M1-P-M2-Motiven, die jeweils aus zwei Transmembran- (TM- oder M-) Helices bestehen, die durch eine Poren- (P-) Helix miteinander verbunden sind. Die vier als Domänen D1 bis D4 bezeichneten Motive sind pseudovierfach symmetrisch angeordnet und bilden zusammen die Pore für die Translokation von Kalium. Jede Pore enthält zwei Strukturmerkmale, von denen angenommen wird, dass sie an der Ionenselektivität und der Steuerung der Ionentranslokation beteiligt sind. Hierbei handelt es sich um einen nicht-kanonischen Selektivitätsfilter und eine Intramembranschleife. Der Selektivitätsfilter befindet sich auf der extrazellulären Seite der Pore und wird hauptsächlich durch die Carbonylgruppen des Rückgrats der P-Schleifen geformt, die die P- und M2-Helices von jeder Domäne verbinden. In KtrB enthält jede P-Schleife nur einen hochkonservierten Glycinrest anstelle der klassischen TVGYG-Sequenz des K+-Kanals. Dieser einfach aufgebaute Selektivitätsfilter führte zu der Hypothese, dass KtrAB nur eine geringe Ionenselektivität aufweist. Die Intramembranschleife wird durch die gebrochene D3M2-Helix gebildet und befindet sich direkt unter dem Selektivitätsfilter. Sie besteht hauptsächlich aus polaren Resten und wirkt als molekulares Tor, welches den Ionenfluss beschränkt. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Intramembranschleife durch Nukleotidbindung an KtrA reguliert wird. Zusätzlich kann sie direkt oder indirekt durch Na+-Bindung beeinflusst werden. Ferner könnte die Intramembranschleife sogar an der Ionenselektivität beteiligt sein, da sie eine physikalische Barriere innerhalb der Pore darstellt. Um die Ionenselektivität des Ktr-Systems zu untersuchen, wurde zunächst die Bindung von KtrB zu unterschiedlichen Ionen untersucht. Die Bindungsaffinitäten verschiedener Kationen an KtrB wurden mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) bestimmt. Hierzu wurde KtrB aus V. alginolyticus in Escherichia coli heterolog hergestellt und gereinigt. Aus 12 L Kultur wurden ungefähr 4 bis 8 mg funktionelles KtrB-Dimer mit Detergens gereinigt. ITC-Messungen wurden in zwei verschiedenen Puffern durchgeführt, einem Puffer auf Cholin-Cl-Basis und einem Puffer auf LiCl-Basis. In dem Puffer auf Cholin-Cl-Basis wurden keine Unterschiede in der Affinität zwischen Na+ (KD = 1,8 mM), K+ (KD = 2,9 mM), Rb+ (KD = 1,9 mM) oder Cs+ (KD = 1,6 mM) festgestellt; nur Li+ zeigte keine Bindung. Im Gegensatz dazu zeigten ITC-Messungen in LiCl-basiertem Puffer eine signifikante Präferenz für K+ (KD = 91 µM) gegenüber Rb+ (KD = 2,4 mM), Cs+ (KD = 1,7 mM) und insbesondere Na+ (für das keine Bindung beobachtet wurde). In ähnlicher Weise führte das Vorhandensein niedriger millimolarer NaCl-Konzentrationen im Choline-Cl-Puffer zu einem verringerten KD-Wert von 260 µM. Es konnte angenommen werden, dass kleine Kationen den Selektivitätsfilter für eine bessere K+-Ionenbindung modulieren und so die K+-Selektivität präferiert wird. Die geringen Bindungsaffinitäten der anderen Ionen könnte darauf hinweisen, dass diese nicht einmal an den Selektivitätsfilter selbst binden, sondern irgendwo im Protein. ITC-Kompetitions-experimente zeigten jedoch, dass alle vier Ionen um die gleichen oder überlappenden Bindungsstellen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass Rb+ und Cs+ die K+-Bindung blockierten, bei Konzentrationen 10-fach über ihren Bindungsaffinitäten. Natrium hingegen bewirkte eine Reduktion der Affinität von K+ zu KtrB bei physiologischen Konzentrationen von 200 mM NaCl. Die Bindungsaffinität betrug immer noch 3,5 mM, was darauf hindeutet, dass Na+ auch an KtrBs Selektivitätsfilter binden kann, jedoch mit einer vergleichsweise geringen Bindungsaffinität. Dementsprechend kann abgeleitet werden, dass eine unerwartet hohe Bindungsselektivität für K+-Ionen besteht. ..

A channel profile report of the unusual K⁺ channel KtrB

KtrAB is a key player in bacterial K+ uptake required for K+ homeostasis and osmoadaptation. The system is unique in structure and function. It consists of the K+-translocating channel subunit KtrB, which forms a dimer in the membrane, and the soluble regulatory subunit KtrA, which attaches to the cytoplasmic side of the dimer as an octameric ring conferring Na+ and ATP dependency to the system. Unlike most K+ channels, KtrB lacks the highly conserved T(X)GYG selectivity filter sequence. Instead, only a single glycine residue is found in each pore loop, which raises the question of how selective the ion channel is. Here, we characterized the KtrB subunit from the Gram-negative pathogen Vibrio alginolyticus by isothermal titration calorimetry, solid-supported membrane-based electrophysiology, whole-cell K+ uptake, and ACMA-based transport assays. We found that, despite its simple selectivity filter, KtrB selectively binds K+ with micromolar affinity. Rb+ and Cs+ bind with millimolar affinities. However, only K+ and the poorly binding Na+ are efficiently translocated, based on size exclusion by the gating loop. Importantly, the physiologically required K+ over Na+ selectivity is provided by the channel's high affinity for potassium, which interestingly results from the presence of the sodium ions themselves. In the presence of the KtrA subunit, sodium ions further decrease the Michaelis-Menten constant for K+ uptake from milli- to micromolar concentrations and increase the Vmax, suggesting that Na+ also facilitates channel gating. In conclusion, high binding affinity and facilitated K+ gating allow KtrAB to function as a selective K+ channel