Genesis and spread of multiple reassortants during the 2016/2017 H5 avian influenza epidemic in Eurasia

Highly pathogenic avian influenza (HPAI) viruses of the H5 A/goose/Guangdong/1/96 lineage can cause severe disease in poultry and wild birds, and occasionally in humans. In recent years, H5 HPAI viruses of this lineage infecting poultry in Asia have spilled over into wild birds and spread via bird migration to countries in Europe, Africa, and North America. In 2016/2017, this spillover resulted in the largest HPAI epidemic on record in Europe and was associated with an unusually high frequency of reassortments between H5 HPAI viruses and cocirculating low-pathogenic avian influenza viruses. Here, we show that the seven main H5 reassortant viruses had various combinations of gene segments 1, 2, 3, 5, and 6. Using detailed time-resolved phylogenetic analysis, most of these gene segments likely originated from wild birds and at dates and locations that corresponded to their hosts' migratory cycles. However, some gene segments in two reassortant viruses likely originated from domestic anseriforms, either in spring 2016 in east China or in autumn 2016 in central Europe. Our results demonstrate that, in addition to domestic anseriforms in Asia, both migratory wild birds and domestic anseriforms in Europe are relevant sources of gene segments for recent reassortant H5 HPAI viruses. The ease with which these H5 HPAI viruses reassort, in combination with repeated spillovers of H5 HPAI viruses into wild birds, increases the risk of emergence of a reassortant virus that persists in wild bird populations yet remains highly pathogenic for poultry

Novel vaccination strategies to protect birds against Asian HP H5N1 influenza viruses

Hoog pathogene Aziatische (AsHP) H5N1 virussen ciruculeren in Azië sinds 1997, en werden enzoötisch in 8 Aziatische landen sinds 2004. De verspr eiding van deze destructieve pluimveeziekte naar zuid-oost Azië, het mid den oosten, Europa en Afrika kon niet voorkomen worden door de aanwendin g van de klassieke inperkingsmaatregelen. De verspreiding van het virus kon deels gekoppeld worden aan vogelmigratie, aangezien de AsHP H5N1 vir ussen in staat zijn watervogels, zoals eenden en ganzen, te infecteren. De combinatie van de hoge virulentie, de enzoötische situatie die ontsto nd in delen van Azië en Afrika, en de verspreiding door zowel gedomestic eerde als wilde vogels geïnfecteerd met het AsHP H5N1 virus, maakte de b eschikbaarheid van efficiënte vaccinatiestrategieën een noodzaak. Hierbi j moet vaccinatie gezien worden als een extra controlemaatregel die geco mbineerd dient te worden met grondige bewaking, bioveiligheid, transport beperkingen, het opvolgen van infectie in gevaccineerde groepen en ander e controlemaatregelen. Om het ultieme doel, het stoppen van transmissie en uiteindelijk de volledige uitroeiing, te bereiken, zijn al deze maatr egelen noodzakelijk. Het doel van deze thesis was de kennis omtrent Aviaire influenza (AI)-va ccinatie tegen AsHP H5N1 virussen uit te breiden. In elke studie werd ee n bepaald gebrek aan kennis bestudeerd door gebruik te maken van verschi llende AsHP H5N1 virussen, verschillende vaccins en verschillende gasthe ren. De efficiëntie van een aantal klassieke geïnactiveerde en nieuwe ge neratie recombinante vaccins tegen AsHP H5N1 infectie werd onderzocht. Voor het evalueren van een vaccin werden een aantal criteria gedefinieer d, maar deze zijn slechts beperkt gestandaardiseerd. Bijgevolg blijft de meest correcte wijze voor vaccin-evaluatie een dierinfectie studie. Alv orens een infectiemodel te ontwikkelen werd een grondige genetische stud ie uitgevoerd op de in ons laboratorium geïsoleerde A/crested eagle/Belg ium/01/2004 clade 1 stam. De volledige genoomsequentie van de arendstam gaf duidelijk zijn Thaise oorsprong weer. De gemeenschappelijke oorspron g van onze clade 1 en het in Hongarije uit gedomesticeerde eenden geïsol eerde clade 2.2 H5N1 virus werd duidelijk wanneer een alignering van bei de sequenties werd uitgevoerd. Voor de ontwikkeling van een infectiemodel werd een grondige virulenties tudie uitgevoerd. Analyse van het dosiseffect en de toedieningswijze wer d uitgevoerd voor zowel de clade 1 AsHP H5N1 stam als een onafhankelijk hoog pathogeen (HP) H7N7 virus geïsoleerd uit kippen in België in 2003. Hieruit werd besloten dat een dosis van minstens 106 EID50 (50% Ei-Infec tieuse Dosis) nodig is om een letale infectie te veroorzaken in kippen v an verschillende leeftijden. De oculonasale weg was minder fataal, in ve rgelijking met intramusculaire infectie, maar werd verkozen omdat dit ee n betere simulatie is van de natuurlijke infectieweg onder laboratorium- condities. Vervolgens werden de gekozen dosis en infectieweg bevestigd m et een tweede AsHP H5N1 virus, een clade 2.2, om de relevantie van deze keuzes aan te tonen voor infectiestudies met andere AsHP H5N1 virussen. Het gastheerbereik werd bestudeerd door verschillende typen eenden en ki ppen te infecteren. De pathogeniciteit van de clade 1 AsHP H5N1 stam voo r kippen bleek voornamelijk bepaald te zijn door dosis en inoculatieweg. Door de hoge pathogeniciteit van beide AsHP H5N1 virussen voor pluimvee kwam het belang van leeftijd en ras minder duidelijk tot uiting. Voor a ndere hoog pathogene aviaire influenza (HPAI) virussen, zoals ons HP H7N 7 virus, met een iets lagere virulentie bij kippen, kwam het belang van leeftijd en ras voor kippen wel duidelijk naar voren. Voor eenden zijn d e leeftijd en het ras bepalend voor de gevoeligheid aan AsHP H5N1. Dankzij deze genetische en experimentele karakterisatie van het virus we rd een goed gefundeerd modelsysteem ontwikkeld dat gebruikt kan worden v oor AsHP H5N1 virussen in toekomstige pathogeniciteits, adaptatie en vac cinatie studies. Voor de evaluatie van vaccin-efficiëntie dient ten eerste het effect op klinische symptomen en mortaliteit te worden bepaald. Bijkomende informa tie kan worden bekomen door het opvolgen van de serologische respons (ho moloog en heteroloog) en de vermindering van virale excretie. Deze bijko mstige indicatoren zijn vooral belangrijk wanneer vaccinatie-efficiëntie moet worden nagegaan bij een gastheer met een beperkte klinische manife statie na infectie, zoals voor Pekin eenden werd aangetoond tijdens het opstellen van het infectiemodel. De vermindering of eliminatie van viral e excretie is van belang voor het stoppen van de overdracht en de uitein delijke uitroeiing van het virus. Voor het opvolgen van virale excretie werd in huis een gevoelige real time retro-transcriptie polymerase keten reactie ((RT)²-PCR) techniek ontwikkeld voor grote aantallen swabstalen . Vaccinatie tegen Aviaire influenza (AI) wordt vooral toegepast in geval van een uitbraak of in een enzootische situatie. Het is wenselijk pluimv ee zo vroeg mogelijk te vaccineren tegen AI. Vaccinatie op dag 1 laat ee n uniformering en automatisering toe in de uitkippingsbedrijven, wat de controle vereenvoudigt en het rondtrekken van vaccinatieteams onnodig ma akt. Vaccinatie op dag 1 laat ook toe een aantal mogelijke immunosuppres sieve infecties in het veld te omzeilen die van belang kunnen zijn wanne er wordt gevaccineerd op een latere leeftijd. Een eerste gebrek aan kennis betreft de vaccinatie-efficiëntie in aanwez igheid van maternale antilichamen (MDA, Maternally Derived Antibodies ) bij jonge kuikens, als gevolg van systematiche vaccinatie, bijvoorbeeld in enzoötische regio s. De MDA kan een bepaalde graad van bescherming b ieden maar kan ook interfereren met vaccinatie. In een eerste studie werd slechts een minimale bescherming van klassieke geïnactiveerde vaccins in vetkuikens, gevaccineerd op 1 dag leeftijd, a angetoond, onafhankelijk van de aanwezigheid van AI-MDA. Dit is het gevo lg van het onrijpe immuunsysteem op deze leeftijd. Een eerste-vaccinatie op 10 dagen leeftijd, met een klassiek geïnactiveerd vaccin, in de aanw ezigheid van AI-MDA gaf echter wel bemoedigende resultaten. Een dubbele vaccinatie blijft echter aan te raden om een optimale bescherming te bek omen, zeker in regio s met een hoge infectiedruk. Voor een zo vroeg mogelijke vaccinatie, dag 1 of in ovo (in het geëmb ryoneerde ei), vormen de levende recombinante vaccins een oplossing a angezien zij een maturatie van de immuunrespons kunnen induceren op jong e leeftijd en bovendien zich dikwijls beter lenen voor de ontwikkeling v an massavaccinatie-strategieën dan geïnactiveerde vaccins. De efficiënti e van deze recombinante vaccins in aanwezigheid van MDA is ook weinig be kend. Twee recombinante fowlpox-H5 (rFP-H5) vaccins, met een hemagglutin ine (HA) met verschillende verwantschap ten opzicht van de AsHP H5N1 vir ussen, werden getest voor hun efficiëntie tegen een AsHP H5N1 infectie i n de aanwezigheid van AI en vector-MDA. In onze handen werd een signifik ante negatieve interferentie gedetecteerd tussen de aanwezigheid van de AI en vector MDA en de bescherming bekomen door vaccinatie in afwezighei d van deze MDA. Via de serologische gegevens werd een beter inzicht bekomen in de immuun respons opgewekt door de rFP-vaccins in kippen. M2-ELISA-resultaten toon den aan dat kippen zonder MDA goed beschermd worden tegen infectie door de rFP-vaccins wat werd bevestigd door de excretie gegevens. Bovendien w erd het belang van HA-homologie tussen het geïnsereerde gen in het recom binant vaccin en de infectie-stam een betere bescherming tot gevolg heef t, opnieuw aan de hand van M2-ELISA op sera en (RT)²-PCR-analyses op clo acale en orofaryngale uitstrijkjes. De negatieve invloed van MDA op de bescherming bekomen door vaccinatie v oor zowel geïnactiveerde als recombinante vaccins kwam duidelijk tot uit ing in de analyse van klinische symptomen, virale excretie en serologisc he reactie in vergelijking met dieren zonder MDA. Zelfs een boost-vaccin atie, met een klassiek geïnactiveerd vaccin op latere leeftijd, kon de i nhibitie van vaccin-geïnduceerde bescherming in aanwezigheid van MDA nie t opheffen. De waargenomen inhibitie lijkt direct gecorreleerd te zijn m et de hoeveelheid residueel MDA op het moment van vaccinatie. Bijgevolg kan de hoeveelheid AI-MDA op dag 1 nuttig zijn om de ideale leeftijd voo r vaccinatie te bepalen. Op het moment dat dit doctoraatsonderzoek startte, was de kennis omtrent AI-vaccinatie in eenden erg beperkt. De efficiëntie van klassieke volle dig virus geïnactiveerde vaccins werd wel al aangetoond in kippen terwij l er voor eenden maar enkele vaccinatiestudies werden gerapporteerd. Om dit kennishiaat in te vullen maakten we een vergelijking van de effic iëntie van een dubbele homologe vaccinatie met een klassiek geïnactiveer d vaccin ten opzichte van een rFP-H5 vaccin in Muscovy eenden. Een belangrijke vermindering van de klinische symptomen en virale excretie werden bekomen in de erg gevoelige Muscovy eenden met zowel het klassiek e geïnactiveerde als het nieuwe fowlpox-vector vaccin. In onze handen le verde de dubbele vaccinatie met het geïnactiveerde vaccin een net iets b etere bescherming op dan het rFP-H5-vaccin. Het belang van HA-homologie tussen de veldstam en het recombinant gen in de vector werd reeds beschreven in vroegere studies op specifief pathog een vrije (SPF)-kippen. Om het voordeel van dag-oude vaccinatie van de n ieuwe generatie vaccins te gebruiken, werd een meer genetisch verwant rF P-H5 vaccin getest in dag-oude SPF Pekin eenden. Verschillende vaccinati e schema s werden geëvalueerd gebruik makend van het geïnactiveerde en/o f het rFP-H5 vaccin. Een volledige bescherming tegen klinische symptomen en virale excretie werd bekomen met de verschillende vaccin-combinaties . Via serologie werd aangetoond dat de breedste immuunrespons en de laag ste inductie van antilichaamproductie na infectie, werd waargenomen in d e groep waarvan het immuunsysteem werd geprimed met de rFP-H5 gevold doo r een boost met het geïnactiveerd vaccin. In onze handen induceerde de prime-boost strategie een optimale immuniteit tegen AsHP H5N1-infectie gecombineerd met een minimale virale replicatie in eenden. Ter conclusie, een goed gevalideerd infectiemodel is onmisbaar voor het evalueren van vaccinatie-efficiëntie. De keuze voor de clade 1 stam werd ondersteund door een gedetailleerde genetische en pathotypische karakte risatie. Er werd aangetoond dat de A/crested eagle/Belgium/01/2004 H5N1 stam kan fungeren als een vertegenwoordiger van een bredere familie viru ssen. De herhaalbaarheid van het infectie-model werd aangetoond en de na tuurlijke situatie werd zo goed mogelijk benaderd onder laboratorium oms tandigheden. Voor het opvolgen van de immuunrespons werd naast de beschikbare hemaggl utinatie inhibitie (HI)-test in huis een test ontwikkeld om geïnfecteerd e en gevaccineerde dieren van elkaar te kunnen onderscheiden (=DIVA-test ). Deze M2-ELISA (matrix proteïne 2) kan ook gebruikt worden voor de eva luatie van vaccin-efficiëntie, door indirecte detectie van virusvermenig vuldiging na infectie. Bovendien werd een hoog gevoelige moleculaire tec hniek ontwikkeld voor de opvolging van virale excretie na infectie. Een aantal belangrijke vragen omtrent AI-vaccinatie werden beantwoord do or onze vaccinatie-infectie-studies. In afwezigheid van MDA bleken de ni euwe generatie levende recombinante vaccins erg succesvol te zijn bij to ediening op dag 1. In geval van continue vaccinatie en het ontstaan van MDA werd een negatieve invloed van de MDA op vaccinatie-efficiëntie waar genomen. Door het bepalen van het ideale moment voor een boost-vaccinati e, op basis van de hoeveelheid residueel MDA, kan deze negatieve interfe rentie verminderd worden. Ook de kennis over AI-vaccinatie bij eenden werd aangevuld. Een prime-bo ost strategie kwam naar voren als een veelbelovende strategie voor de in ductie van bescherming in watervogels tegen een AsHP H5N1 infectie. De b rede immuunrespons geïnduceerd door de prime-boost vaccinatie induceerde zowel klinische bescherming als een significante reductie van virale ex cretie. Uit onze resultaten stellen wij een prime-boost vaccinatie voor met een recombinant vaccin, met een HA-gen dat nauw verwant is met de circuleren de stam, dat niet al te gevoelig is voor MDA gevolgd door een breed-spec trum olie-in-water geïnactiveerd vaccin. Een dergelijke strategie heeft een goed potentieel om in de toekomst gebruikt te worden voor AI-vaccina tie.TABLE OF CONTENTS Dankwoord Samenvatting - Summary I List of abbreviations XI Table of contents XV Introduction 1 1 General introduction to the influenza A world 2 1.1 Etiology 1.2 Nomenclature 1.3 Infection-replication cycle 1.4 Ecology and Epidemiology 1.5 Role of HA and NA in pathogenicity and antigenicity of AI 2 The Asian highly pathogenic avian influenza H5N1 epizootic 13 2.1 Past HPAI outbreaks 2.2 The Asian H5N1 epizootic (1996-now) 3 Vaccination against avian influenza in birds 18 3.1 AI prophylaxis and legislation 3.2 Protective immune response against influenza A infection 3.3 Vaccination against AI 3.3.1 Dead vaccines 3.3.2 Live vaccines 3.4. Efficacy of AI vaccines in other bird species 3.5 AI Vaccination Strategies 3.6 DIVA strategies Aims of the study 31 Material and Methods 33 1 Viral strains used 34 2 Animal Studies 34 3 Statistical analysis 34 4 Swab-sampling to monitor viral excretion 35 5 Preparation of a primary CEF- culture 35 6 Virology 35 6.1 Hemagglutination (HA)-test 6.2 Virus Isolation (VI) and Titration 6.3 Intravenous pathogenicity index (IVPI) 7 Molecular biology 38 7.1 RNA extraction 7.2 (RT)²-PCR 7.3 Genetic characterisation 8 Serology 44 8.1 HI-test 8.2 Fowlpox ELISA 8.3 M2-ELISA 9 Buffers and Solutions 46 CHAPTER I: Defining a challenge model for the “A/Crested_Eagle/Belgium/01/2004”-isolate 49 I.1 Introduction 50 I.2 Experimental design 50 I.2.1 Challenge virus I.2.2 Experimental setup I.3 Results 51 I.3.1 Genetic characterisation I.3.2 Pathogenic Characterisation I.4 Discussion 56 CHAPTER II: Development of a universal endogenously controlled and quantitative (RT)²-PCR for Asian HPAI H5N1 57 II.1 Introduction 58 II.2 Experimental design 59 II.2.1 Challenge virus II.2.2 Experimental setup II.3 Results 59 II.3.1 Quantification of (RT)²-PCR inhibition by cloacal and oropharyngeal swabs. II.3.2 Optimization of the influenza (RT)²-PCR protocol for samples containing RT-PCR inhibitors II.3.3 Development of a universal avian endogenous internal control II.3.4 Validation of β-Act as normaliser control for virus quantification II.3.5 Validation of internally controlled Taq-boosted (RT)²-PCR influenza detection protocol II.3.6 Multiplex (RT)²-PCR influenza M-gene and β-Act II.4 Discussion 66 CHAPTER III: The influence of passive humoral immunity on vaccination efficacy for classical and new generation recombinant vaccines against Asian HPAI H5N1 69 III.1 Introduction 70 III.2 Experimental design 71 III.2.1 Challenge virus III.2.2 Vaccines III.2.3 Experimental setup III.2.3.1 Protection afforded by inactivated vaccines in broilers and their interference with MDA III.2.3.2 Protection afforded by recombinant fowlpox vaccines and their interference with MDA III.2.3.2.1 Interference of MDA with the induction of protection by two fowlpox-vectored H5-vaccines III.2.3.2.2 Interference of MDA with the induction of protection by different vaccination strategies III.3 Results 74 III.3.1 Interference of MDA with the induction of protection by inactivated vaccines in broilers III.3.1.1 Vaccination of broilers with a classical H5N2 inactivated vaccine III.3.1.2 Vaccination of day-old broilers with classical inactivated vaccines III.3.2 Interference of MDA with the induction of protection by recombinant fowlpox-H5 vaccines III.3.2.1 Development of a fowlpox-ELISA to measure the anti-fowlpox passive antibodies III.3.2.2 Interference of MDA with the induction of protection by two fowlpox-vectored H5-vaccines III.3.2.3 Interference of MDA with the induction of protection by different vaccination strategies III.4 Discussion 91 III.4.1 Interference of anti-H5-MDA with the induction of protection by classical inactivated vaccines III.4.1.1 Passive protection afforded by MDA IIII.4.1.2 Active protection in the presence of MDA III.4.2 Interference of anti-H5- and anti-vFP-MDA with the induction of protection by new generation fowlpox vaccines CHAPTER IV: Efficacy of an inactivated and a fowlpox-vectored vaccine in Muscovy Ducks against an Asian HPAI H5N1 Challenge 97 IV.1 Introduction 98 IV.2 Experimental design 99 IV.2.1 Challenge virus IV.2.2 Vaccines IV.2.3 Experimental setup IV.3 Results 100 IV.4 Discussion 104 CHAPTER V: Prime-boost vaccination with a fowlpox vectored and inactivated AI vaccine in Pekin ducks 107 V.1 Introduction 108 V.2 Experimental design 109 V.2.1 Challenge virus V.2.2 Vaccines V.2.3 Experimental setup V.2.3.1 Challenge study V.2.3.2 Immunogenicity study V.3 Results 111 V.3.1 Challenge study V.3.2 Immunogenicity study V.4 Discussion 115 CHAPTER VI: General discussion and Future perspectives 119 VI.1 Vaccination against avian influenza and its limitations 120 VI.2 Discussion 122 VI.3 Conclusion 127 VI.4 Gaps and future perspectives 128 REFERENCES 129 LIST OF PUBLICATIONS 149The study presented in this work was performed at the Veterinary and Agrochemical Research institute, VAR, Ukkel, Belgium. The work was supported by a research grant of the federal government, DG4-research.nrpages: 150status: publishe

What's in a strain?: viral metagenomics identifies genetic variation and contaminating circoviruses in laboratory isolates of pigeon paramyxovirus type 1

&lt;p&gt;We used next generation sequencing on random amplified viral nucleic acids to determine the genome sequence of 11 pigeon paramyxovirus type 1 (PPMV-1) isolates from Belgium (period 1998-2011). The PPMV-1 deep sequence data allowed identification of sequence variability in multiple PPMV-1 isolates, including one STOP codon in the Matrix gene which was present in 15% of the viral population of one isolate. Notably, mutations that were previously associated with pathogenicity in chickens were identified as minor sequence variants in one parent laboratory strain. A phylogenetic analysis of the consensus PPMV-1 genome sequences was performed. In addition to providing nearly complete paramyxovirus genome sequences, our sequence-independent approach identified the presence of pigeon circovirus (PiCV) sequences in four of these viral stocks. Real-time quantitative RT-PCR analysis specific for PMV-1 and PiCV showed that these contaminations were present in seven viral stocks consisting of allantoic fluids and was occasionally also detected in stocks passaged in embryonated chicken eggs. Phylogenetic analysis of the PiCV consensus genome sequences showed a circulation of PiCV covering the full genetic diversity of known PiCV. This study shows the value of novel sequence independent technologies for access to sequence information for the control of reference virus stocks and other biological materials, as co-infecting viruses or sequence variants from the original sample may persist in the stocks without being identified by the routine virus-specific diagnostic tools. The exact role of PiCV in pigeon disease - in particular Newcastle disease - and its potential interference with PPMV-1 diagnostics remains to be investigated.&lt;/p&gt;</p

Usutu virus epizootic and Plasmodium coinfection in Eurasian blackbirds (Turdus merula) in Flanders, Belgium

At the end of the summer of 2016, unusually high levels of mortality were detected in Passeriformes and Strigiformes in Flanders, Belgium, mainly in Eurasian Blackbirds (Turdus merula). A passive surveillance program demonstrated a widespread Usutu virus outbreak and revealed a coinfection with Plasmodium in 99% of the dead passerine birds that were necropsied

Study of the underlying mechanisms and consequences of pathogenicity differences between two in vitro selected G1-H9N2 clones originating from a single isolate

Abstract The G1-H9N2 avian influenza virus (AIV) has caused significant economic losses in the commercial poultry industry due to reduced egg production and increased mortality. The field observations have shown that H9N2 viruses circulate and naturally mix with other pathogens and these simultaneous infections can exacerbate disease. To avoid an incorrect virus characterization, due to co-infection, isolates were purified by in vitro plaque assays. Two plaque purified G1-H9N2 clones, selected on different cell types, named MDCK-and CEF-clone in regards to the cell culture used, were studied in vivo, revealing two different virulence phenotypes. Subsequently, the underlying mechanisms were studied. Specifically, the phenotypical outcome of SPF bird infection by the two clones resulted in completely different clinical outcomes. These differences in clinical outcome were used to study the factors behind this output in more detail. Further studies demonstrated that the more severe disease outcome associated with the MDCK-clone involves a strong induction of pro-inflammatory cytokines and a lack of type I interferon production, whereas the mild disease outcome associated with the CEF-clone is related to a greater antiviral cytokine response. The immunosuppressive effect of the MDCK-clone on splenocytes was further demonstrated via ChIFN-γ lack production after ex vivo mitogenic stimulation. Genome sequencing of the two clones identified only four amino acid differences including three in the HA sequence (HA-E198A, HA-R234L, HA-E502D-H9 numbering) and one in the NA sequence (NA-V33M). In the present study, valuable insights on the mechanisms responsible for AI pathogenicity and molecular mechanisms of H9N2 infections in chicken were obtained while highlighting the impact of the cells viruses are grown on their virulence

Complete coding sequence of a novel picorna-like virus in a blackbird infected with Usutu virus

Using random high-throughput RNA sequencing, the complete coding sequence of a novel picorna-like virus (a 9,228-nt contig containing 212,202 reads) was determined from a blackbird (Turdus merula) infected with Usutu virus. This sequence shares only 36% amino acid sequence identity with its closest homolog, arivirus 1, (an unclassified member of the order Picornavirales), and shares its dicistronic genome arrangement. The new virus was therefore tentatively named "blackbird arilivirus" (ari-like virus). The nearly complete genome sequence consists of at least 9,228 nt and contains two open reading frames (ORFs) encoding the nonstructural polyprotein (2235 amino acids) and structural polyprotein (769 amino acids). Two TaqMan RT-qPCR assays specific for ORF1 confirmed the presence of high levels of this novel virus in the original sample. Nucleotide composition analysis suggests that blackbird arilivirus is of dietary (plant) origin.status: accepte

The Mus musculus Mx1 gene confers strong protection against highly pathogenic influenzavirus A H5N1

peer reviewe

Detection and Isolation of Swine Influenza A Virus in Spiked Oral Fluid and Samples from Individually Housed, Experimentally Infected Pigs: Potential Role of Porcine Oral Fluid in Active Influenza A Virus Surveillance in Swine

<div><p>Background</p><p>The lack of seasonality of swine influenza A virus (swIAV) in combination with the capacity of swine to harbor a large number of co-circulating IAV lineages, resulting in the risk for the emergence of influenza viruses with pandemic potential, stress the importance of swIAV surveillance. To date, active surveillance of swIAV worldwide is barely done because of the short detection period in nasal swab samples. Therefore, more sensitive diagnostic methods to monitor circulating virus strains are requisite.</p><p>Methods</p><p>qRT-PCR and virus isolations were performed on oral fluid and nasal swabs collected from individually housed pigs that were infected sequentially with H1N1 and H3N2 swIAV strains. The same methods were also applied to oral fluid samples spiked with H1N1 to study the influence of conservation time and temperature on swIAV infectivity and detectability in porcine oral fluid.</p><p>Results</p><p>All swIAV infected animals were found qRT-PCR positive in both nasal swabs and oral fluid. However, swIAV could be detected for a longer period in oral fluid than in nasal swabs. Despite the high detectability of swIAV in oral fluid, virus isolation from oral fluid collected from infected pigs was rare. These results are supported by laboratory studies showing that the PCR detectability of swIAV remains unaltered during a 24 h incubation period in oral fluid, while swIAV infectivity drops dramatically immediately upon contact with oral fluid (3 log titer reduction) and gets lost after 24 h conservation in oral fluid at ambient temperature.</p><p>Conclusions</p><p>Our data indicate that porcine oral fluid has the potential to replace nasal swabs for molecular diagnostic purposes. The difficulty to isolate swIAV from oral fluid could pose a drawback for its use in active surveillance programs.</p></div

Comparison of swine influenza A virus isolation from oral fluid samples and nasal swab samples collected from pigs sequentially infected with (A) swine influenza A virus strains sw/Gent/28/10 (H1N1) at day 0 and (B) sw/Gent/172/08 (H3N2) at day 21 in embryonated chicken eggs (ECE) and in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell culture.

<p>Comparison of swine influenza A virus isolation from oral fluid samples and nasal swab samples collected from pigs sequentially infected with (A) swine influenza A virus strains sw/Gent/28/10 (H1N1) at day 0 and (B) sw/Gent/172/08 (H3N2) at day 21 in embryonated chicken eggs (ECE) and in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell culture.</p

Influence of conservation time and temperature on qRT-PCR detectability of swine influenza A virus in porcine oral fluid.

<p>H1N1 virus stock was spiked in porcine oral fluid or PBS to final concentrations of either 1 x 10^8.7 EID₅₀ / mL or 1 x 10^4.7 EID₅₀ / mL. The spiked samples were conserved either at 4°C or at room temperature (22°C ± 2°C) and at 0, 0.5, 2, 6 and 24 h after spiking, aliquots were collected and stored at -80°C. After RNA extraction using the MagMAX Pathogen RNA/DNA kit (Life Technologies), swIAV RNA was amplified with the Vetmax Gold swIAV detection kit (Life Technologies). Mean Ct values (± standard error) of three independent replicates are shown.</p