Silencing of Vlaro2 for chorismate synthase revealed that the phytopathogen Verticillium longisporum induces the cross-pathway control in the xylem

The first leaky auxotrophic mutant for aromatic amino acids of the near-diploid fungal plant pathogen Verticillium longisporum (VL) has been generated. VL enters its host Brassica napus through the roots and colonizes the xylem vessels. The xylem contains little nutrients including low concentrations of amino acids. We isolated the gene Vlaro2 encoding chorismate synthase by complementation of the corresponding yeast mutant strain. Chorismate synthase produces the first branch point intermediate of aromatic amino acid biosynthesis. A novel RNA-mediated gene silencing method reduced gene expression of both isogenes by 80% and resulted in a bradytrophic mutant, which is a leaky auxotroph due to impaired expression of chorismate synthase. In contrast to the wild type, silencing resulted in increased expression of the cross-pathway regulatory gene VlcpcA (similar to cpcA/GCN4) during saprotrophic life. The mutant fungus is still able to infect the host plant B. napus and the model Arabidopsis thaliana with reduced efficiency. VlcpcA expression is increased in planta in the mutant and the wild-type fungus. We assume that xylem colonization requires induction of the cross-pathway control, presumably because the fungus has to overcome imbalanced amino acid supply in the xylem

Analysis of Verticillium longisporum induced senescence and transdifferentiation in Arabidopsis thaliana

Verticillium longisporum (Vl43) ist ein bodenbürtiger Pilz, dessen Hauptwirt Raps ist. Vl43 infiziert die Pflanzen über die Wurzeln und breitet sich systemisch über das Leitgefäßsystem in der Pflanze aus. Es konnte in dieser Arbeit erfolgreich ein in vitro-Assay etabliert werden, der eine zellbiologische Charakterisierung der Proliferation von Verticillium in Arabidopsis Wurzeln erlaubte und der für etwaige "Mutantenscreens" verwendet werden könnte. Die Analysen zeigten, dass V. longisporum über endodermisfreie Zonen, wie zum Beispiel der Wurzelspitze, das Leitgefäßsystem besiedelte. Ansonsten wurde die Ausbreitung des Pilzes von der Endodermis in der Wurzeldifferenzierungszone blockiert. Der systemische Infektionsverlauf von Vl43 in Arabidopsis wurde weiter in den Blättern zellbiologisch analysiert und dabei konnte spezifisch in Blattgeweben ein Transdifferenzierungsphänomen beobachtet werden. Der Fokus dieser Arbeit lag auf den Symptomen der verfrühten (induzierten) Seneszenz und der beobachteten Transdifferenzierung von Bündelscheidezellen zu de novo Xylemelementen.Die Ergebnisse der Arbeit deuten an, dass V. longisporum aktiv Seneszenz induziert, um die nekrotrophe Phase des Pilzes und die Vollendung seines Lebenszyklus vorzubereiten. Es kam von frühen Zeitpunkten der Infektion an zu einer starken Reduktion der Cytokininkonzentration, die als Folge Seneszenz auslöste. Die Modifikation der Cytokinin-Homöostase wird durch erhöhte Expression der Cytokininoxidasen bewirkt, wobei der genaue Mechanismus, wie Verticillium dies steuert, weiterhin unbekannt ist. Durch pharmakologische und genetische Ansätze konnte eine Stabilisierung der Cytokinin-Homöostase erreicht werden, die zu einer deutlichen Reduktion der Vl43-induzierten Seneszenz und daraus resultierend zu einer inhibierten Proliferation des Pilzes führte. Dementsprechend liegt eine direkte Korrelation zwischen reduzierter Cytokininkonzentration und Seneszenz vor. Erstmalig konnte in dieser Arbeit ein in der Wirtspflanze stattfindender Transdifferenzierungsprozess durch Vl43-Infektion beschrieben werden. Dabei werden hauptsächlich Bündelscheidezellen de novo zu Xylemelementen umgewandelt. Die Transdifferenzierung der Bündelscheidezellen korreliert mit dem yellow vein-Symptom und ist wahrscheinlich ein Teilfaktor für den stunting-Phänotyp (verursacht durch den streckungsunfähigen Metaxylemanteil in den de novo Xylemelementen).Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der genetische Mechanismus der Transdifferenzierung auf den Prozessen der natürlichen Xylementwicklung basiert, die über VNDs (NAC-Transkriptionsfaktoren) gesteuert wird. Des Weiteren wurde versucht, die biologische Relevanz für dieses Phänomen zu belegen. Dabei konnte ausgeschlossen werden, dass Verticillium die de novo Xylemelemente für eine bessere Proliferation benutzt. Die de novo gebildeten Xylemelemente könnten zur Aufrechterhaltung des Wasserhaushaltes dienen. Für die Theorie spricht die nachgewiesene Funktionalität der neugebildeten Xylem-Elemente. Auch das Ausbleiben von Welke in Vd830-infizierten Tomatenpflanzen und die Welkeerscheinungen in Vd830-infizierten Tabakpflanzen mangels starker Transdifferenzierung unterstützten die Hypothese. Allerdings führte eine Unterdrückung der Transdifferenzierung durch VND7-Repression zu keiner Welke in Arabidopsis, so dass diese Theorie durch die bisher erhaltenen Ergebnisse nicht unterstützt wird. Interessanterweise führte die Blockierung der Transdifferenzierung zu einem leicht veränderten Krankheitsbild. Die Pflanzen zeigten nach Infektion eine physiologische Zweiteilung der Rosette, wobei der source-Bereich deutlich Seneszenz aufwies, der sink-Bereich hingegen weitestgehend grün und relativ uninfiziert aussah. Dementsprechend wurde eine Hypothese aufgestellt, dass die Transdifferenzierung möglicherweise ein Prozess ist, um den Reimport von Nährstoffen in sink-Bereiche der Pflanze zu stören. Damit könnte der Pilz diese in der nekrotrophen Phase selber nutzen. Durch einen C14-Glukose Transportversuch konnten erste Hinweise auf veränderte sink-source Verhältnisse in der infizierten Pflanze erhalten werden

Thermostable WW-Domain Scaffold to Design Functional β-Sheet Miniproteins

There has been a recent surge in the design of miniproteins for medicinal chemistry, biomaterial design, or synthetic biology. In particular, there is an interest in peptide scaffolds that fold reliably, predictably, and with solid stability. In this article, we present the design of a highly thermostable WW domain, a three-stranded β-sheet motif, with a superior melting temperature of about 90 °C to serve as a core scaffold onto which receptor-like properties can be grafted. We have performed specific rounds of sequence iteration on a WW-domain consensus sequence to decipher sequence positions that affect structural and, thus, thermal stability. We identified a sequence–structure relationship that yields a highly thermostable WW-domain scaffold. High-resolution NMR spectroscopy was applied, which enabled the identification of structural features at the atomic scale that contribute to this high thermostability. Finally, we grafted the binding motifs of the three WW-domain groups─Group I, Group II/III, and Group IV─and organophosphate and metal binding onto the highly thermostable WW-domain scaffold and obtained thermostable de novo WW domains that indeed display the different binding modes that were intended. The organophosphate-binding WW domains exhibit melting temperatures that are up to 34 K higher than previously reported top-down designs. These results impressively demonstrate that the highly thermostable WW-domain core scaffold is a solid platform for the design of discrete and reliably folding functional β-sheet peptide miniproteins, providing an essential addition to the toolbox of peptide scaffolds previously used in synthetic biology and material design.publishe

Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana

Verticillium longisporum and Verdcillium dahliae are soil borne vascular pathogens. Under standard laboratory growth conditions both fungi infect Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 plants via primary and lateral (secondary) root tips and colonize the vascular cylinder including proto- and metaxylem. After entry into the hypocotyl both Verticillium species spread into petioles and leaves, but with different efficiency and distinct disease symptom patterns. V. longisporum typically induces early senescence whereas V. dahliae infections cause wilting. In both cases, these symptoms coincide with the switch from a biotrophic to a necrotrophic life style. Fungal proliferation analyses monitored by quantitative real-time PCR and anatomical studies show that V. dahliae is able to colonize aerial plant parts more efficiently compared to V. longisporum. Moreover, V. longisporum-infection triggers hyperplastic xylem formation and cellular transdifferentiation in Arabidopsis, whereas V. dahliae-infection induces enhanced xylem lignification. We have recently shown that V. longisporum induced de novo xylem formation results in enhanced drought stress tolerance, suggesting a conditionally mutualistic interaction. Here we show that on the contrary V. dahliae infections do not provide protection of the plant against drought. Together, our results demonstrate that V. dahliae and V. longisporum induce distinct and species-specific developmental and structural alterations in Arabidopsis, which differently affect plant fitness under concomitant abiotic drought stress conditions. (C) 2013 Elsevier B.V. All rights reserved