Epidemiology and control of grey mould in hydroponic lettuce production

Grey mould, caused by Botrytis cinerea, is one of the major fungal diseases of vegetable crops growing under cover during the winter-early spring period, in Greece. On lettuce, the pathogen usually attacks the base of the plant and eventually leads on basal stem rot and death. For three consecutive years (2010, 2011, 2012) the epidemiological development of B. cinerea was studied on lettuce grown in hydroponics in relation to microclimate and the amount of airborne inoculum. Primary infections were observed 20 days after transplanting: the pathogen invaded the basal stem of the plants via the older, weakened leaves. Infections were increased when the moisture (relative humidity and/or leaf wetness) and airborne inoculum levels were increased for prolonged periods. Temperature was not the main determinant in the development of epidemics. In parallel, the effectiveness of various fungicide spray applications against grey mould was evaluated. Two standard applications were made at seedling stage followed up by one or two more sprays after transplanting, at 15-day intervals. The last application was made at least 4 weeks before harvest. Applications only at seedling stage with Daconil SC (chlorothalonil 50%) 3ml·L-1, Teldor WG (fenhexamid 50%) 1.5g·L-1, Signum WG (boscalid 26.7% + pyraclostrobin 6.7%) 1.5g·L-1, Switch WG (fludioxonil 25% + cyprodinil 37.5%) 0.5g·L-1and Ortiva Οpti SC (azoxystrobin 8% + chlorothalonil 40%) 2.5ml·L-1, reduced significantly the disease incidence and severity, compared to untreated control. The fungicides Switch WG and Signum WG provided the best control, whereas Teldor WG and Daconil SC were less effective. The level of the disease was further reduced with one or two more fungicide applications after transplanting. Fungicides programs were effective despite the predominance of B. cinerea resistant phenotypes in five (QoIRBosRAniRBenHRDicMR) and seven (HydRQoIRBosRAniRPhenRBenHRDicMR) different classes of fungicides, isolated from diseased plants and the glasshouse air. For avoiding the development of resistance, alternative fungicide applications were found necessary. With the exception of applications after transplanting with Daconil SC (chlorothalonil 50%) in all other treatments, no fungicide residues were detected or these were under the European acceptable MRLs, at harvest.The minimum inhibitory concentration (MIC) for spore germination and mycelial growth to nine fungicides of different chemical groups in 100 B. cinerea isolates, was determined in vitro. These concentrations were selected to assess fungicide sensitivity in 818 isolates from lettuce and other vegetable crops, by the use of the point inoculation method. Three phenotypes with multiple resistance to stobilurins (QoI), carboximides (Bos), hydroxyanilides (Hyd), anilinopyrimidines (Ani), phenylpyrroles (Phen), dicarboximides (Dic) and benzimidazoles (Βen), [HydRQoIRBosRAniRPhenMRBenHRDicMR, QoIRBosRAniRBenHRDicMR, QoIRBosRBenHRDicMR] were detected at frequency 7%, 12% and 6%, respectively. These phenotypes were mainly isolated from a glasshouse lettuce crop located in Thessaly. Isolates with single high resistance to benzimidazoles counted 11% in total, and mainly originated from open field lettuce grown in Macedonian or Peloponnesian district. Phenotypes with various resistance combinations (1 to 5 chemical groups) were found in less frequency (<5%). No resistant phenotypes to fluazinam (dinitroanilides) and chlorothalonil (phthalonitriles) were detected. B. cinerea phenotypes exhibiting multiple resistance against seven groups of fungicides, high resistance to fenhexamid (Hyd) and moderate resistance to fludioxonil (Phen), were recorded for the first time in Greece. For reducing grey mould losses the application of anti-resistant strategies is considered necessary.The efficacy of seven fungicides with different mode of action against nine multiple resistant isolates of B. cinerea was tested in situ. The fungicides used were: pyraclostrobin (strobilurins), boscalid (carboxamides), fenhexamid (hydroxyanilides), cyprodinil (anilinopyrimidines), fludioxonil (phenylpyrroles), fluazinam (dinitroanilines) and chlorothalonil (phthalonitriles). Young lettuce leaves (cv. Penelope RZ) immersed in aqueous fungicide suspensions at the recommended spraying concentrations (a.i. %). When the leaves got dried they were placed in Petri dishes with sterilized water agar. Then, inoculations taken place by transferring upside down a 5 mm mycelial disc or a drop of a spore suspension (5x104 mL-1) on the adaxial leaf surface. Fungicide efficacy was evaluated by measuring the size of infection lesion after 3 (mycelium) or 6 (spores) day incubation, respectively, in a growth chamber of 18°C and 10 h lighting. The fungicides pyraclostrobin (0.4 g·L-1) and fenhexamid (1.5 g·L-1) failed to inhibit the development of Botrytis lesion by the resistant isolates, in all tests. Similar results were provided by boscalid (0.8 g·L-1), cyprodinil (0.375 and 0.75 g·L-1) and fludioxonil (0.25 and 0.5 g·L-1) when mycelial discs were used as inoculum. With the exception of one case the fungicides fluazinam (0.4 g·L-1) and chlorothalonil (2.5 g·L-1) were effective against all isolates tested. These results showed the inability of recently introduced fungicides to inhibit the infection by B. cinerea resistant phenotypes obtained from lettuce crops.A novel, high-resolution melting (HRM) analysis was developed to detect single nucleotide polymorphisms associated with resistance to fenhexamid (hydroxyanilides), pyraclostrobin (QoIs), boscalid (SDHIs), carbendazim (benzimidazoles and iprodione (dicarboximides), in B. cinerea isolates. HRM analysis is a PCR based closed-tube method for the detection of DNA sequence variation by demonstrating fluorescence changes in the melting profile of the amplified double stranded DNA amplicon. The identification of the melting curves showed that resistance to fenhexamid was due to a nucleotide change in the erg27 gene, resulting in an amino acid replacement of phenylalanine with valine (58% of the isolates) or serine (42%) at position 412 of the protein. Likewise, in isolates resistant to boscalid, a nucleotide change in the sdhB gene resulted in the replacement of histidine with arginine (78%) or tyrosine (22%) at position 272 of the respective protein. A replacement of glycine with alanine at position 143 of cytochrome b was detected in highly resistant to the QoIs isolates, but not in all cases. In the same amplicon the presence of an extra 1205bp intron was detected in the 43% of the sensitive isolates. Amino acid substitutions E198A and F200Y in BenA gene were associated with high and moderate resistance to carbendazim, respectively. Polymorphism was much stronger in moderately resistant to iprodione isolates where 4 different genotypes were detected in the amplicon: a) I365N (46%), b) I365S (17%), c) Q369P & N373S (17%), d) V368F & Q369H (20%). Additionally, further discrimination of the isolates based on the presence of transposable elements boty and flipper in the genome revealed that 80% of the isolates carried both elements, 15% none and 5% only the boty. Overall, genotyping showed that most multiple resistant phenotypes were characterized by random mutations. However, in some cases there was a significant correlation of some mutations with specific phenotypes. HRM’s comparative advantages over traditional molecular techniques revealed the great potential of this assay in tracking resistance.Ο βοτρύτης (παθογόνο αίτιο Botrytis cinerea) είναι μία από τις σημαντικότερες ασθένειες των κηπευτικών που καλλιεργούνται σε συνθήκες θερμοκηπίου στην χώρα μας κατά την περίοδο του χειμώνα-αρχές της άνοιξης. Σε καλλιέργεια μαρουλιού το παθογόνο προσβάλει το λαιμό των φυτών με αποτέλεσμα τη σήψη της βάσεως του στελέχους και την αποκοπή της κεφαλής από το ριζικό σύστημα. Για τρία συνεχή χρόνια (2010, 2011, 2012) έγινε μελέτη της επιδημιολογίας του παθογόνου σε μαρούλια υδροπονικής καλλιέργειας με καταγραφή των συνθηκών μικροκλίματος και του εναέριου πληθυσμού. Το παθογόνο εισερχόταν στο λαιμό των φυτών από τα κατώτερα εξασθενημένα φύλλα και προκαλούσε μόλυνση με ορατά συμπτώματα προσβολής 20 ημέρες μετά τη μεταφύτευση. Οι προσβολές ήταν αυξημένες όταν επικρατούσε παρατεταμένη υψηλή υγρασία (σχετική υγρασία, διύγρανση φύλλων) και αυξημένη συγκέντρωση εναερίου μολύσματος ενώ, η θερμοκρασία δεν είχε καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη της ασθένειας. Παράλληλα, αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα διαφόρων προγραμμάτων χημικών επεμβάσεων κατά της ασθένειας. Έγιναν δύο ψεκασμοί ασφαλείας στο σπορείο σε συνδυασμό με μία ή δύο επιπλέον επεμβάσεις μετά τη μεταφύτευση, ανά 15μερα διαστήματα. Η συγκομιδή έγινε τουλάχιστον 4 εβδομάδες μετά την τελευταία επέμβαση μυκητοκτόνου. Οι ψεκασμοί ασφαλείας στο σπορείο με Daconil SC (chlorothalonil 50%) 3 ml·L-1, Teldor WG (fenhexamid 50%) 1.5 g·L-1, Signum WG (boscalid 26.7% + pyraclostrobin 6.7%) 1.5 g·L-1, Switch WG (fludioxonil 25% + cyprodinil 37.5%) 0.5 g·L-1 και Ortiva Οpti SC (azoxystrobin 8% + chlorothalonil 40%) 2.5 ml·L-1, μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα και την ένταση της προσβολής σε σχέση με το μάρτυρα. Τα μυκητοκτόνα Switch WG και Signum WG έδωσαν την καλύτερη καταπολέμηση ενώ τα Teldor WG και Daconil SC ήταν λιγότερο αποτελεσματικά. Η εφαρμογή ενός ή δύο επιπλέον ψεκασμών μετά τη μεταφύτευση μείωσαν περαιτέρω το επίπεδο της ασθένειας. Η σταθερή ύπαρξη στο θερμοκήπιο ανθεκτικού πληθυσμού του παθογόνου φαίνεται ότι δεν περιόρισε την αποτελεσματικότητα των βοτρυδιοκτόνων. Δύο κυρίαρχοι φαινότυποι ανθεκτικοί σε πέντε (QoIRBosRAniRBenHRDicMR) και επτά (HydRQoIRBosRAniRPhenRBenHRDicMR) διαφορετικού τρόπου δράσης ομάδες μυκητοκτόνων εντοπίστηκαν είτε στο εναέριο μόλυσμα, είτε απομονώθηκαν από φυτά του πειραματικού ή του ευρύτερου χώρου του θερμοκηπίου. Για τη μείωση του κινδύνου ανάπτυξης ανθεκτικότητας η εναλλαγή μυκητοκτόνων στο πρόγραμμα επεμβάσεων βρέθηκε απαραίτητη. Με εξαίρεση τις επεμβάσεις μετά τη μεταφύτευση με Daconil SC (chlorothalonil 50%), σε όλες τις άλλες περιπτώσεις είτε δεν ανιχνεύθηκαν υπολείμματα μυκητοκτόνων κατά τη συγκομιδή ή ανευρέθηκαν σε συγκεντρώσεις κατώτερες από αυτές που έχουν θεσπιστεί από την Ευρωπαϊκή Κοινότητα.Σε θρεπτικά υποστρώματα εμπλουτισμένα με διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεως βοτρυδιοκτόνων από εννιά διαφορετικές ομάδες, προσδιορίστηκε η ελάχιστη παρεμποδιστική συγκέντρωση (MIC) της βλάστησης των σπορίων και του σχηματισμού αποικίας σε 100 απομονώσεις του B. cinerea. Με τη μέθοδο της σημειακής εναπόθεσης σπορίων οι συγκεντρώσεις αυτές επιλέχθηκαν για το διαχωρισμό των επιπέδων ευαισθησίας σε 818 απομονώσεις του παθογόνου από μαρούλια και άλλα κηπευτικά. Τρεις φαινότυποι με πολλαπλή ανθεκτικότητα στις υδροξυανιλίδες (Hyd), τις στρομπιλουρίνες (QoI), τα καρβοξαμιδικά (Bos), τις ανιλινοπυριμιδίνες (Ani), τις φαινυλοπυρρόλες (Phen), τα δικαρβοξιμιδικά (Dic) και τα βενζιμιδαζολικά (Βen), [HydRQoIRBosRAniRPhenMRBenHRDicMR, QoIRBosRAniRBenHRDicMR, QoIRBosRBenHRDicMR] ανευρέθηκαν σε συχνότητα 7%, 12% και 6%, αντίστοιχα. Οι φαινότυποι αυτοί εντοπίστηκαν κυρίως σε καλλιέργεια θερμοκηπίου μαρουλιού στην περιοχή της Θεσσαλίας. Απομονώσεις ανθεκτικές μόνο στα βενζιμιδαζολικά (BenHR) βρέθηκαν στο 11% του δείγματος και προέρχονταν κυρίως από υπαίθριες καλλιέργειες μαρουλιού στη Μακεδονία και Πελοπόννησο. Σε χαμηλότερη συχνότητα (<5%) διαπιστώθηκαν φαινότυποι που παρουσίαζαν από 1 έως 5 διαφορετικούς συνδυασμούς ανθεκτικότητας στις χημικές ομάδες. Στο σύνολο των απομονώσεων που εξετάστηκαν δεν ανευρέθηκαν ανθεκτικά στελέχη στα μυκητοκτόνα fluazinam (δινιτροανιλίνες) και chlorothalonil (φθαλονιτρίλια). Από τα ευρήματα διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα η παρουσία φαινοτύπων του B. cinerea με πολλαπλή ανθεκτικότητα σε επτά διαφορετικές ομάδες μυκητοκτόνων και η παρουσία στελεχών με υψηλή ανθεκτικότητα στο fenhexamid (Hyd) και μέτρια στο fludioxonil (Phen), αντίστοιχα. Για τη μείωση των ζημιών από βοτρύτη η εφαρμογή στρατηγικής διαχείρισης της ανθεκτικότητας κρίνεται απαραίτητη.Διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα in situ επτά μυκητοκτόνων διαφορετικού βιοχημικού τρόπου δράσεως [pyraclostrobin (στρομπιλουρίνες), boscalid (καρβοξαμιδικά), fenhexamid (υδροξυανιλίδες), cyprodinil (ανιλινοπυριμιδίνες), fludioxonil (φαινυλοπυρρόλες), fluazinam (δινιτροανιλίνες) και chlorothalonil (φθαλονιτρίλια)], κατά εννιά επιλεγμένων με πολλαπλή ανθεκτικότητα απομονώσεων του B. cinerea. Νεαρά φύλλα μαρουλιού (ποικ. Penelope RZ) εμβαπτίστηκαν σε υδατικό αιώρημα μυκητοκτόνων, στη συνιστώμενη για ψεκασμό συγκέντρωση σε δ.ο. Μετά το στέγνωμα τα φύλλα τοποθετήθηκαν σε τριβλία Petri με αποστειρωμένο υπόστρωμα άγαρ. Ακολούθησε μόλυνση στη πάνω επιφάνεια με εναπόθεση ανεστραμμένου μυκηλιακού δίσκου διαμέτρου 5 mm ή σταγόνας αιωρήματος σπορίων συγκέντρωσης 5x104 mL-1. Η αποτελεσματικότητα αξιολογήθηκε με μέτρηση της διαμέτρου ανάπτυξης της κηλίδας προσβολής του παθογόνου, έπειτα από 3 (μόλυσμα μυκήλιο) ή 6 (μόλυσμα σπόρια) μέρες επώαση, αντίστοιχα, σε θάλαμο θερμοκρασίας 18°C και 10h φωτισμού. Τα pyraclostrobin (0.4 g·L-1) και fenhexamid (1.5 g·L-1) απέτυχαν να εμποδίσουν την ανάπτυξη κηλίδας προσβολής των ανθεκτικών σε αυτά φαινοτύπων σε όλες τις περιπτώσεις δοκιμών. Παρόμοια αποτελέσματα διαπιστώθηκαν για τα boscalid (0.8 g·L-1), cyprodinil (0.375 και 0.75 g·L-1) και fludioxonil (0.25 και 0.5 g·L-1) όταν χρησιμοποιήθηκε ως μόλυσμα μυκήλιο. Απεναντίας, τα μυκητοκτόνα fluazinam (0.4 g·L-1) και chlorothalonil (2.5 g·L-1) ήταν αποτελεσματικά σχεδόν εναντίον όλων (εκτός από μία περίπτωση) των φαινοτύπων του παθογόνου. Από τα αποτελέσματα διαφαίνεται η αδυναμία πρόσφατα εισαχθέντων μυκητοκτόνων να εμποδίσουν την προσβολή από ανθεκτικούς φαινοτύπους του B. cinerea που απομονώθηκαν από καλλιέργειες μαρουλιού.Με τη νέα μέθοδο της θερμικής αποδιάταξης υψηλής ανάλυσης (HRM) τριάντα έξι διαφορετικής ευαισθησίας απομονώσεις του B. cinerea διαχωρίστηκαν γονοτυπικά με βάση μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς που προσδίδουν ανθεκτικότητα στα μυκητοκτόνα fenhexamid, boscalid, pyraclostrobin, carbendazim και iprodione. Η βασική αρχή λειτουργίας της μεθόδου είναι ο προσδιορισμός του ρυθμού αποδιάταξης του δίκλωνου DNA με τη βοήθεια φθορίζουσας χρωστικής και ο σχηματισμός των χαρακτηριστικών καμπυλών τήξης του κάθε γενοτύπου. Μετά από ταυτοποίηση των καμπυλών τήξης βρέθηκε ότι τα ανθεκτικά στο fenhexamid στελέχη παρουσίασαν μετάλλαξη της φαινυλαλανίνης είτε σε βαλίνη (58% των απομονώσεων) είτε σε σερίνη (42% των απομονώσεων) στη θέση 412 του γονιδίου erg27. Παρομοίως, τα ανθεκτικά στο boscalid στελέχη έφεραν τη μετάλλαξη της ιστιδίνης είτε σε αργινίνη (78%) είτε σε τυροσίνη (22%) στη θέση 272 του γονιδίου sdhB. Στα ανθεκτικά στο pyraclostrobin στελέχη η μετάλλαξη της γλυκίνης σε αλανίνη παρουσιαζόταν στη θέση 143 του κυτοχρώματος b αλλά όχι πάντοτε. Στην ίδια γενωματική περιοχή ανιχνεύθηκε η ύπαρξη ενός εσονίου 1205 βάσεων στο 43% των ευαίσθητων στα QoIs στελεχών. Η υψηλή και μέτρια ανθεκτικότητα στο carbendazim συνδυάστηκε με μεταλλάξεις σε δύο διαφορετικές, πολύ κοντινές θέσεις του γονιδίου BenA (E198A και 200Υ). Έντονος πολυμορφισμός διαπιστώθηκε στα μετρίως ανθεκτικά στο iprodione στελέχη καθώς στο γονίδιο bos1 ανιχνεύθηκαν τέσσερεις διαφορετικοί γενότυποι ήτοι: α) I365N (46%), β) I365S (17%), γ) Q369P & N373S (17%), δ) V368F & Q369H (20%). Επιπρόσθετη πληθυσμιακή κατάταξη των απομονώσεων με βάση την ύπαρξη μεταθετών στοιχείων boty και flipper έδειξε ότι το 80% των απομονώσεων έφερε και τα δύο μεταθετά στοιχεία, το 15% κανένα από τα δύο ενώ το 5% μόνο το boty μεταθετό στοιχείο. Η γoνοτύπηση έδειξε ότι στους περισσότερους φαινοτύπους πολλαπλής ανθεκτικότητας οι μεταλλάξεις ήταν τυχαίες, ωστόσο σε κάποιες περιπτώσεις υπήρξε υψηλή συσχέτιση ορισμένων μεταλλάξεων με συγκεκριμένους φαινοτύπους. Τα συγκριτικά πλεονεκτήματα της μεθόδου HRM έναντι των παραδοσιακών μοριακών τεχνικών την καθιστούν ιδανική για μελέτες ανίχνευσης ανθεκτικών στελεχών

Efficient Control of Apple Scab with Targeted Spray Applications

For two consecutive growing seasons (2017 and 2018), three different fungicide spray programs, each with five sprays from unrelated chemical groups, were evaluated for their effectiveness against apple scab (causal agent: Venturia inaequalis) in an experimental trial in Greece. The targeted application programs consisted of five sprays with protective and systemic fungicides from unrelated chemical groups, in alternation. The applications were started at the pink bud stage (a copper-based fungicide had previously been applied at the green bud stage) and completed at the second fruit fall to arrest the primary infections by ascospores. These five-spray programs were compared to the standard farmer practice (12 sprays per season), whereas untreated plots were used as controls. The timing of the applications was based: a) on the critical growth stage of the crop, and b) on the risk analysis for infection calculated by the software Field Climate, which incorporated meteorological data from the trial site. All the five-spray programs were of very high efficacy against apple scab, showing disease severity ratings on leaves and fruits below 1.88%. In both years, in the untreated control, the disease incidence and severity on leaves ranged from 96.5% to 99.3% and from 65.2% to 75.93%, respectively. The five-spray programs showed similar efficacy to the standard 12-application program in all cases. From the results, it becomes apparent that apple scab can be controlled effectively by five targeted applications with selected fungicides at critical growth stages of the crop

Detection of Venturia inaequalis Isolates with Multiple Resistance in Greece

The excessive use of fungicides against Venturia inaequalis, the causal agent of apple scab, has led to the emergence of resistant populations to multiple fungicides over the years. In Greece, there is no available information on fungicide resistance, despite the fact that control failures have been reported on certain areas. An amount of 418 single-spore isolates were collected from three major apple production areas and tested for their sensitivity to eight commonly used fungicides from unrelated chemical groups. The isolates were tested on malt extract agar media enriched with the discriminatory dose of each fungicide using the point inoculation method. To define the discriminatory dose for assessing the levels of resistance, EC50 values on both spore germination and mycelial growth assays were previously determined. Isolates exhibiting high resistance to trifloxystrobin (92% in total) and difenoconazole (3%); and moderate resistance to cyprodinil (75%), dodine (28%), difenoconazole (36%), boscalid (5%), and fludioxonil (7%) were found for the first time in Greece. A small percentage of the isolates were also found less sensitive to captan (8%) and dithianon (6%). Two isolates showed various levels of resistance to all eight fungicides. Despite the occurrence of strains with multiple resistances to many fungicides, we concluded that this practical resistance in the field arose mainly due to the poor control of apple scab with trifloxystrobin and difenoconazole

Development of a two-step high-resolution melting (HRM) analysis for screening sequence variants associated with resistance to the QoIs, benzimidazoles and dicarboximides in airborne inoculum of Botrytis cinerea

A rapid, high-resolution melting (HRM) analysis protocol was developed to detect sequence variations associated with resistance to the QoIs, benzimidazoles and dicarboximides in Botrytis cinerea airborne inoculum. HRM analysis was applied directly in fungal DNA collected from air samplers with selective medium. Three and five different genotypes were detected and classified according to their melting profiles in BenA and bos1 genes associated with resistance to benzimidazoles and dicarboximides, respectively. The sensitivity of the methodology was evident in the case of the QoIs, where genotypes varying either by a single nucleotide polymorphism or an additional 1205-bp intron were separated accurately with a single pair of primers. The developed two-step protocol was completed in 82min and showed reduced variation in the melting curves' formation. HRM analysis rapidly detected the major mutations found in greenhouse strains providing accurate data for successfully controlling grey mould

Global Transcriptome Analysis of the Peach (<i>Prunus persica</i>) in the Interaction System of Fruit–Chitosan–<i>Monilinia fructicola</i>

The peach (Prunus persica L.) is one of the most important stone-fruit crops worldwide. Nevertheless, successful peach fruit production is seriously reduced by losses due to Monilinia fructicola the causal agent of brown rot. Chitosan has a broad spectrum of antimicrobial properties and may also act as an elicitor that activate defense responses in plants. As little is known about the elicitation potential of chitosan in peach fruits and its impact at their transcriptional-level profiles, the aim of this study was to uncover using RNA-seq the induced responses regulated by the action of chitosan in fruit–chitosan–M. fructicola interaction. Samples were obtained from fruits treated with chitosan or inoculated with M. fructicola, as well from fruits pre-treated with chitosan and thereafter inoculated with the fungus. Chitosan was found to delay the postharvest decay of fruits, and expression profiles showed that its defense-priming effects were mainly evident after the pathogen challenge, driven particularly by modulations of differentially expressed genes (DEGs) related to cell-wall modifications, pathogen perception, and signal transduction, preventing the spread of fungus. In contrast, as the compatible interaction of fruits with M. fructicola was challenged, a shift towards defense responses was triggered with a delay, which was insufficient to limit fungal expansion, whereas DEGs involved in particular processes have facilitated early pathogen colonization. Physiological indicators of peach fruits were also measured. Additionally, expression profiles of particular M. fructicola genes highlight the direct antimicrobial activity of chitosan against the fungus. Overall, the results clarify the possible mechanisms of chitosan-mediated tolerance to M. fructicola and set new foundations for the potential employment of chitosan in the control of brown rot in peaches

High-Resolution Melting approaches towards plant fungal molecular diagnostics

Reliable and early molecular detection of phytopathogenic fungi is crucial in an era where the expansion of global trade in plant material is undoubtedly increasing the risk of invasive outbreaks, with devastating effects in crop production. Genetic variation within and between fungal species or strains is also important for screening isolates regarding various resistance attributes. Until today many approaches have been employed in fungal diagnostics which are either labor- and time-consuming or costly and of reduced sensitivity. Here, we demonstrate and review recent advances on high-resolution melting (HRM) analysis as a rapid, accurate and powerful tool, capable of differentiating even closely related fungal isolates. HRM technique is based on monitoring the melting of PCR amplicons, using saturating concentrations of a fluorescent intercalating dye that binds to double-stranded DNA. Additionally, we discuss the four case studies inferring applications of HRM analysis towards either genotyping of closely related fungal species or screening for fungicide resistance. We focus on the promising results of these studies, giving some technical considerations and describing the advantages of the application of this approach. Finally, we discuss current prospects and applications for research and development related to this innovative HRM technique in plant fungal diagnostics

Detection and characterization of fungicide resistant phenotypes of Botrytis cinerea in lettuce crops in Greece

The development of resistance to chemical control agents needs continuous monitoring in Botrytis cinerea. 790 isolates from lettuce and other vegetable crops were collected from six widely separated sites in Greece and tested for their sensitivity to 11 fungicides from nine unrelated chemical groups. 44 of the isolates exhibited multiple resistance to fenhexamid (hydroxyanilides), azoxystrobin and pyraclostrobin (QoI's), boscalid (SDHI's), cyprodinil and pyrimethanil (anilinopyrimidines), fludioxonil (phenylpyrroles), carbendazim (benzimidazoles) and iprodione (dicarboximides). Thirty per cent of such phenotypes were detected in an experimental glasshouse with lettuce crops, the third year after commencing fungicide applications. The average resistance factor (R-f) for mycelial growth to fenhexamid, pyraclostrobin, boscalid, cyprodinil and fludioxonil, was over 40, 1,000, 100, 700 and 50, respectively. Some strains with high resistance to anilinopyrimidines (14 %) or moderate to fludioxonil (7 %) were detected even in isolates collected from vegetable crops prior to commercial use of these fungicides in Greece. Isolates with fludioxonil moderate resistance and fenhexamid high resistance, were detected for the first time in Greece. The results suggested the high risk in chemical control of grey mould due to development of resistance to most fungicides with site-specific modes of action. Isolates with resistance to fluazinam (phenylpyridinamines) and to chlorothalonil (phthalonitriles) were not found. The inclusion of appropriate multi-site inhibitors like chlorothalonil in fungicide anti-resistance strategies was indispensable