The β-fructofuranosidase from Rhodotorula dairenensis: Molecular cloning, heterologous expression, and evaluation of its transferase activity

The β-fructofuranosidase from the yeast Rhodotorula dairenensis (RdINV) produces a mixture of potential prebiotic fructooligosaccharides (FOS) of the levan-, inulin-and neo-FOS series by transfructosylation of sucrose. In this work, the gene responsible for this activity was characterized and its functionality proved in Pichia pastoris. The amino acid sequence of the new protein contained most of the characteristic elements of β-fructofuranosidases included in the family 32 of the glycosyl hydrolases (GH32). The heterologous yeast produced a protein of about 170 kDa, where N-linked and O-linked carbohydrates constituted about 15% and 38% of the total protein mass, respectively. Biochemical and kinetic properties of the heterologous protein were similar to the native enzyme, including its ability to produce prebiotic sugars. The maximum concentration of FOS obtained was 82.2 g/L, of which 6-kestose represented about 59% (w/w) of the total products synthesized. The potential of RdINV to fructosylate 19 hydroxylated compounds was also explored, of which eight sugars and four alditols were modified. The flexibility to recognize diverse fructosyl acceptors makes this protein valuable to produce novel glycosyl-compounds with potential applications in food and pharmaceutical industriesThis work was supported by Spanish Ministry of Economy and Competitiveness: BIO2016- 76601-C3-2 and of Science and Innovation PID2019-105838RB-C32; Fundación Ramón Areces (XIX Call of Research Grants in Life and Material Sciences); and by institutional grant from Fundación Ramón Areces to the Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. CBMSO Proteomics Facility belongs to ProteoRed PRB2-ISCIII and was supported by the grant PT13/0001. M.G.-P. was supported by the Spanish Ministry of Education’s University Personnel Training Plan (FPU

Estudio de la a-glucosidasa de Schwanniomyces occidentalis para la síntesis de isomaltooligosacáridos y otros compuestos glucosilados

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 19-11-2021Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 19-05-2023La GAM1 de Scwanniomyces occidentalis es una α-glucosidasa extracelular que hidroliza enlaces α1-4 glucosídicos de oligosacáridos formados por unidades de glucosa como la maltosa o la maltotriosa. Además, esta enzima es capaz de transferir unidades de glucosa para formar isomaltooligosacáridos (IMOs) como la isomaltosa, isomaltotriosa y panosa que tienen interés en la industria alimentaria por sus características prebióticas. La enzima también produce maltotriosa. En este trabajo la α-glucosidasa GAM1 se expresó heterólogamente en Pichia pastoris, se realizó su caracterización bioquímica y se estudió su capacidad para sintetizar IMOs en distintas condiciones. Entre ellas, y tras la adición de distintas concentraciones de glucosa, se logró sesgar la especificidad transferasa de la enzima hacia la producción de azúcares que contienen solamente enlaces α1-6, sobre todo isomaltosa, quedando inhibida la síntesis de los trisacáridos panosa y maltotriosa. Se exploró la capacidad de GAM1 para glucosilar distintos tipos de aceptores, entre ellos azúcares y polifenoles, logrando producir varios trisacáridos formados por la unión de una glucosa a sacarosa mediante distintos tipos de enlaces a la unidad de glucosa, y disacáridos de glucosil-xilosa en los que se formaron distintos tipos de enlace entre las unidades constituyentes. GAM1 glucosiló también piceido, un derivado monoglucosilado del resveratrol, generando mono- y diglucósido del piceido, en los que las unidades de glucosa se unieron a la unidad glucosídica del aceptor. Los nuevos productos generados fueron purificados y su estructura identificada mediante RMN. Se estudió también la estructura tridimensional de GAM1 mediante modelados por homologías y se abordó el estudio de su especificidad utilizando Evolutionary Trace y mutagénesis dirigida hacia residuos de su bolsillo catalítico implicados en los subsitios -1, +1 y +2. La mayoría de las sustituciones realizadas afectaron en mayor o menor medida a la capacidad transferasa de la enzima que alteraron las proporciones producidas de IMOs. Una de las sustituciones en particular incrementó especialmente la producción de IMOs hasta prácticamente duplicarla, principalmente la de isomaltosa e isomaltotriosa, además produjo pequeñas cantidades de un nuevo disacárido formado por dos unidades de glucosas unidas por enlace α1-1, la trehalosa. Por último, abordamos la inmovilización de GAM1 sobre bolas de quitosano utilizando dos linkers diferentes (glutaraldehído y genipina), se optimizaron las condiciones de la inmovilización y se analizó tanto la estabilidad operacional del sistema como a distintos valores de pH y temperatura. La estabilidad operacional para las reacciones de transglicosilación fue superior al usar glutaraldehíd

A three-step process for the bioconversion of whey permeate into a glucose-free D-tagatose syrup

We have developed a sustainable three-stage process for the revaluation of cheese whey permeate into D-tagatose, a rare sugar with functional properties used as sweetener. The experimental conditions (pH, temperature, cofactors, etc.) for each step were independently optimized. In the first step, concentrated whey containing 180–200 g/L of lactose was fully hydrolyzed by β-galactosidase from Bifidobacterium bifidum (Saphera®) in 3 h at 45 °C. Secondly, glucose was selectively removed by treatment with Pichia pastoris cells for 3 h at 30 °C. The best results were obtained with 350 mg of cells (previously grown for 16 h) per mL of solution. Finally, L-arabinose isomerase US100 from Bacillus stearothermophilus was employed to isomerize D-galactose into D-tagatose at pH 7.5 and 65 °C, in presence of 0.5 mM MnSO4. After 7 h, the concentration of D-tagatose was approximately 30 g/L (33.3% yield, referred to the initial D-galactose present in whey). The proposed integrated process takes place under mild conditions (neutral pH, moderate temperatures) in a short time (13 h), yielding a glucose-free syrup containing D-tagatose and galactose in a ratio 1:2 (w/w).This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (Grants BIO2016-76601-C3-1-R and C3-2-R) and Fundación Ramón Areces (XIX Call of Research Grants in Life and Material Sciences). We thank Fundación Ramón Areces for an institutional grant to the Center of Molecular Biology Severo Ochoa. F.V. Cervantes thanks CONACYT (Mexico) for her Ph.D. fellowship (Ref. 440242)

Análisis de la actividad de transglicosilación de la α-glucosidasa GAM1 de la levadura Schwanniomyces occidentalis

Trabajo presentado en la 32ª ed. de la reunión científica regional "ZYMOMADRID" organizada por la Sra. Catedrática en Microbiología y Pasitología Dra. dña. María Molina Martín (Dpto. Microbiología II, Fac. Farmacia, UCM) en el Campus de Moncloa (UCM, Madrid, España) durante el día 09 de marzo de 2018La microbiota intestinal tiene un impacto directo en la salud del hospedador, lo que genera un gran interés en encontrar nuevas formas de manipular la composición y la actividad de determinados tipos de bacterias para mejorar la calidad de vida. Por esta razón, existe un creciente interés industrial en el desarrollo de nuevos productos con nuevas y/o mejores propiedades. En este contexto, los carbohidratos prebióticos estimulan selectivamente el crecimiento y/o la actividad de bacterias del tracto intestinal que son consideradas beneficiosas para la salud, entre ellas algunas especies de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus. Los isomaltooligosacáridos (IMOS) son azúcares prebióticos con un grado de polimerización de unos 2 a 10 monómeros de glucosa unidos mediante enlaces glucosídicos α(1-2, -3, ó -6), aunque también pueden contener uniones α(1-4). Para la producción de IMOS se pueden utilizar principalmente 2 tipos de enzimas: glucosidasas y glucosil-transferasas. Las α-glucosidasas (EC 3.2.1.20) por su estructura tridimensional y su secuencia se incluyen dentro de la familia 31 de las Glicosil Hidrolasas (GH31) (http://www.cazy.org/). Estas enzimas hidrolizan, por lo general, los enlaces α(1-4) del extremo no reductor de polímeros de glucosa y liberan las unidades constituyentes. Algunas de ellas muestran actividad de transglicosilación (TG) en condiciones saturantes de sustrato. La α-glucosidasa GAM1 de Schwanniomyces occidentalis además de hidrolizar maltooligosacáridos presenta actividad TG sobre maltosa. Por transferencia produce isomaltosa, kojibiosa, panosa, maltotriosa y otros productos de mayor tamaño. En este estudio, el gen de Gam1 (2883pb), responsable de la actividad α-glucosidasa GAM1, fue aislado a partir de DNA genómico de Sw. occidentalis, clonado en pIB4 bajo el control del promotor inducible por metanol AOX1p y transformado en Pichia pastoris. La proteína heteróloga fue expresada y utilizada en reacciones de TG basadas en maltosa y distintos aceptores no hidrolizables por la enzima. Los productos obtenidos fueron analizados mediante HPLC. Además, se realizó un estudio preliminar de la estructura 3D de la proteína y se obtuvieron distintos mutantes puntuales de la misma que fueron bioquímicamente analizados.N

Structural Analysis of β-Fructofuranosidase from Xanthophyllomyces dendrorhous Reveals Unique Features and the Crucial Role of N-Glycosylation in Oligomerization and Activity

Xanthophyllomyces dendrorhous β-fructofuranosidase (XdINV)is a highly glycosylated dimeric enzyme that hydrolyzes sucrose and releases fructose from various fructooligosaccharides (FOS) and fructans. It also catalyzes the synthesis of FOS, prebiotics that stimulate the growth of beneficial bacteria in human gut. In contrast to most fructosylating enzymes, XdINV produces neo-FOS, which makes it an interesting biotechnology target. We present here its three-dimensional structure, which shows the expected bimodular arrangement and also a long extension of its C terminus that together with an N-linked glycan mediate the formation of an unusual dimer. The two active sites of the dimer are connected by a long crevice, which might indicate its potential ability to accommodate branched fructans. This arrangement could be representative of a group of GH32 yeast enzymes having the traits observed in XdINV. The inactive D80A mutant was used to obtain complexes with relevant substrates and products, with their crystals structures showing at least four binding subsites at each active site. Moreover, two different positions are observed from subsite +2 depending on the substrate, and thus, a flexible loop (Glu-334–His-343) is essential in binding sucrose and β(2–1)-linked oligosaccharides. Conversely, β(2–6) and neo-type substrates are accommodated mainly by stacking to Trp-105, explaining the production of neokestose and the efficient fructosylating activity of XdINV on α-glucosides. The role of relevant residues has been investigated by mutagenesis and kinetics measurements, and a model for the transfructosylating reaction has been proposed. The plasticity of its active site makes XdINV a valuable and flexible biocatalyst to produce novel bioconjugates