Efeito do protocolo de sincronização celular na produção de clones bovinos.

Os métodos de sincronização da célula doadora de núcleo para uso em clonagem baseiam-se no bloqueio reverslvel do ciclo celular em pontos especlficos. Idealmente, espera-se que esse bloqueio não provoque prejulzo à viabilidade do embrião reconstituldo após a transferência de núcleo. Este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência do processo de clonagem (taxa de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez) a partir de dois protocolos de sincronização celular: privação de soro fetal bovino (SFB) ou cultivo celular até confluência. Oócitos bovinos foram recuperados por aspiração folicular postmortem e maturados in vitro (MIV) por 18h em TCM-199 suplementado com 10% de SFB, 1 ug/mL FSH, 50ug/ mL hCG, 1 ug/mL estradiol, 0,2mM piruvato de sódio e 83,4~g/mL amicacina em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C. Oócitos apresentando extrusão do primeiro corpúsculo polar foram selecionados, corados com 10ug/mL de Hoechst 33342 e enucleados em fluido sintético de oviduto (SOF) tamponado com HEPES, suplementado com 10% de SFB e 7,5ug/mL de citocalasina B. A reconstituição oocitâria foi realizada com dois grupos de fibroblastos bovinos: Grupo A - cultivados sob privação de SFB por 3 a 5 dias (Dulbecco's Modified Eagle Medium -DMEM suplementado com 0,5% de SFB); ou Grupo B -cultivados até confluência (DMEM suplementado com 10% de SFB). Conjuntos citoplasto+fibroblasto foram eletrofundidos em solução de manitol 0,28M, com dois pulsos de corrente direta de 2,OKv/cm e duração de 20s cada. A ativação foi realizada por exposição à ionomicina (5 minutos, 5~M) seguida de incubação em SOF suplementado com 20mM cloreto de estrôncio e .\ O~g/mL de citocalasina B por 6 horas. Os provâveis zigotos foram co-cultivados com células da granulosa em SOF suplementado com 2,5% de SFB e 0,5% de BSA em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C por 7 dias. Alguns blastocistos de cada grupo foram transferidos para fêmeas receptoras previamente sincronizadas. As taxas de eletrofusão e produção de blastocistos dos dois grupos foram submetidas à ANOVA, com nlvel de significância de 5%. Houve diferença signiticativaentre os grupos A e B quanto às taxas de eletrofusão: 3,66o/a:!:137,% (549 fundido sem 1631 reconstituidos) contra 40,07% % 11,95% (696 fundidos em 1737 reconstituidos), respectivamente; e quanto ao desenvolvimento até blastocisto: 20,58% % 13,84% (113 blastocistos em 549) contra 34,77o/a:!:1 0,47% (242 blastocistos em 696), respectivamente. Tais diferenças proporcionaram produção média de 5,65 e 12,74 blastocistos por sessão de micromanipulação nos grupos A e B, respectivamente. No grupo A não foram diagnosticadas prenhezes aos 30 dias em 25 receptoras inovuladas; no grupo B foram diagnosticadas 4 gestações a partir de II inovulações (36,4%). Embora a privação de SFB permita o desenvolvimento a termo de clones bovinos (Campbell et al., Nature, 380:64, 1996), existem relatos de maior fragmentação de DNA após utilização da privação (Gibbons et aI., Biol Reprod, 66:895, 2002). Ainda, as menores taxas de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez observadas no grupo A em comparação ao B, indicam que o uso de fibrob'astos submetidos à privação de SFB não é justiticâvel para o procedimento de clonagem em bovinos

Expressão de DNA metiltransferases em blastocistos bovinos produzidos in vivo e in vitro.

Nos mamiferos, a metilação do DNA é essencial na regulação da expressão gênica e na diferenciação celular. Uma proporção elevada de embriões produzidos por transferência nuclear (TN) é incapaz de estabelecer e sustentar a gestação a termo. Há grande consenso que alterações epigenéticas, primariamente causadas por alterações nos padrões de metilação do DNA, resultam em expressão gênica anormal em embriões e fetos clonados, tomando os indices de sucesso da clonagem frustrantes. Este trabalho objetivou analisar os padrões de expressão das DNA metiltransferases (DNMT) I, 3A e 3B em blastocistos bovinos produzidos in vivo (grupo IV) ou in vilro por FIV (grupo FlV) e transferência nuclear a partir de fibroblastos submetidos à privação de soro fetal bovino (SFB) durante o cultivo (grupo TN-S), ou cultivados até a confluência (grupo TN-C). Uma vez que a linhagem celular doadora de núcleo era proveniente de uma fêmea, os blastocistos dos grupos IV e FIV foram sexados por PCR e somente aqueles do sexo feminino foram utilizados nas etapas posteriores. Após remoção da zona pelucida em PBS pH 2,5, os blastocistos foram individualmente submetidos a um ciclo de amplificação linear do RNA mensageiro utilizando o "Superscript RNA amplification system" (L-l 016, Invitrogen). A transcrição reversa de volume correspondente a I/IOdo RNA de um embrião foi realizada com 6,75JlM de hexâmeros randômicos e transcriptase reversa (Improm-lI Reverse Transcriptase, Promega) seguindo instruções do fabricante. Os ensaios de quantificação relativa dos transcritos dos genes DNMTI, DNMT3A e DNMT3B foram realizados por PCR em tempo real com sistema de detecção TaqMan* (Applied Biosystems); utilizando o gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) como controle endógeno. Foram utilizados oito embriões por grupo, amplificados em quadruplicata. A eficiência média das amplificações por PCR foi estimada para cada gene utilizando-se uma regressão linear do logaritmo da tluorescência a cada ciclo (Ramakers et aI., Neurosci. Lett., 339:62, 2003); e as razões de expressão calculadas de acordo com metodologia descrita por Livak e Schmittgen (Methods, 25:402, 2001). Para verificar as diferenças significativas foi utilizado o "Pair wise fixed reallocation randomization tes(' (Pfaffi et ai., Nucleic Acids Res., 30:e36. 2002). Todas as razões de expressão foram normalizadas pelo GAPDH e calibradas em função do grupo IV. Não foram detectados transcritos da DNMTI nos blastocistos do grupo TN-S, em contra partida. não se verificaram diferenças estatisticas (P>0,05) entre as razões de expressão dos grupos FIV (0,95) e TN-C (0,77). comparados ao grupo IV. Os grupos de transferência nuclear (TN-C e TN-S) apresentaram razões de expressão numericamente superiores para a DNMT3A (1,89 e 1,99; respectivamente) e para a DNMT3B (1,31 e 2,08; respectivamente) quando comparados aos grupos fertilizados (IV e FIV: 1,00 e 1,50 para DNMT3A; e 1,00 e 1,29 para DNMT3B; respectivamente). no entanto, sem diferenças significativas (P>0,05). A ausência de expressão da DNMTI no grupo TN com fibroblastos submetidos à privação de SFB nos leva a sugerir que embriões clonados a partir deste protocolo sejam menos viáveis do que aqueles oril,lndos de fibroblastos cultivados até confluência. A falta de DNMTl compromete a metilação do DNA a cada ciclo celular e toma os embriões inaptos a manterem as marcações epigcnéticas após cada mitose e sustentar o desenvolvimento fetal

Vascular Wall-Resident CD44+ Multipotent Stem Cells Give Rise to Pericytes and Smooth Muscle Cells and Contribute to New Vessel Maturation

Here, we identify CD44(+)CD90(+)CD73(+)CD34(−)CD45(−) cells within the adult human arterial adventitia with properties of multipotency which were named vascular wall-resident multipotent stem cells (VW-MPSCs). VW-MPSCs exhibit typical mesenchymal stem cell characteristics including cell surface markers in immunostaining and flow cytometric analyses, and differentiation into adipocytes, chondrocytes and osteocytes under culture conditions. Particularly, TGFß1 stimulation up-regulates smooth muscle cell markers in VW-MPSCs. Using fluorescent cell labelling and co-localisation studies we show that VW-MPSCs differentiate to pericytes/smooth muscle cells which cover the wall of newly formed endothelial capillary-like structures in vitro. Co-implantation of EGFP-labelled VW-MPSCs and human umbilical vein endothelial cells into SCID mice subcutaneously via Matrigel results in new vessels formation which were covered by pericyte- or smooth muscle-like cells generated from implanted VW-MPSCs. Our results suggest that VW-MPSCs are of relevance for vascular morphogenesis, repair and self-renewal of vascular wall cells and for local capacity of neovascularization in disease processes

Produtividade e vigor do maracujazeiro-amarelo plantado em covas e plantio direto sob manejo orgânico.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o vigor e a produtividade do maracujazeiro-amarelo plantado em diferentes tamanhos de cova e plantio direto sob manejo orgânico. O experimento foi conduzido de 2005 a 2007, no Setor de Agricultura Ecológica da Universidade Federal do Acre, em delineamento de blocos casualizados, constituídos de cinco tratamentos, quatro repetições e quatro plantas por parcela. Foram avaliados cinco tipos de preparo do solo: T1 cova do tamanho do torrão (0,19 x 0,063m) com adubação em cobertura; T2 cova de 0,30 x 0,30 x 0,30m com adubação de plantio na cova; T3 cova de 0,30 x 0,30 x 0,30m com adubação de plantio em cobertura; T4 cova de 0,50 x 0,50 x 0,50m com adubação de plantio na cova; e T5 cova de 0,50 x 0,50 x 0,50m com adubação de plantio em cobertura. O tamanho da cova e o plantio direto não influenciaram o vigor da planta e a biomassa de raízes. O número de frutos por planta e a produtividade, na segunda e na somatória das duas safras, foram maiores com plantio direto e com covas cúbicas de 0,30m. Após dois anos de cultivo, a densidade do solo foi maior na camada de 0-5cm de profundidade num raio de 20cm da planta para o plantio em covas de 0,50m com adubação na cova e menor para o plantio direto, não havendo diferença entre os demais tratamentos. O plantio direto ou o plantio em covas pequenas com dimensões de 0,30 x 0,30 x 0,30m proporcionou maior produtividade de maracujá que o plantio em covas maiores, mesmo não influenciando o vigor das plantas e a massa seca de raízes

Human bone marrow mesenchymal stem cells : a systematic reappraisal via the genostem experience

Genostem (acronym for “Adult mesenchymal stem cells engineering for connective tissue disorders. From the bench to the bed side”) has been an European consortium of 30 teams working together on human bone marrow Mesenchymal Stem Cell (MSC) biological properties and repair capacity. Part of Genostem activity has been dedicated to the study of basic issues on undifferentiated MSCs properties and on signalling pathways leading to the differentiation into 3 of the connective tissue lineages, osteoblastic, chondrocytic and tenocytic. We have evidenced that native bone marrow MSCs and stromal cells, forming the niche of hematopoietic stem cells, were the same cellular entity located abluminally from marrow sinus endothelial cells. We have also shown that culture-amplified, clonogenic and highly-proliferative MSCs were bona fide stem cells, sharing with other stem cell types the major attributes of self-renewal and of multipotential priming to the lineages to which they can differentiate (osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and vascular smooth muscle cells/pericytes). Extensive transcription profiling and in vitro and in vivo assays were applied to identify genes involved in differentiation. Thus we have described novel factors implicated in osteogenesis (FHL2, ITGA5, Fgf18), chondrogenesis (FOXO1A) and tenogenesis (Smad8). Another part of Genostem activity has been devoted to studies of the repair capacity of MSCs in animal models, a prerequisite for future clinical trials. We have developed novel scaffolds (chitosan, pharmacologically active microcarriers) useful for the repair of both bone and cartilage. Finally and most importantly, we have shown that locally implanted MSCs effectively repair bone, cartilage and tendonWork supported by the European Community (Key action 1.2.4-3 Integrated Project Genostem, contract No 503161)

Isolation and Characterization of Novel Murine Epiphysis Derived Mesenchymal Stem Cells

BACKGROUND: While bone marrow (BM) is a rich source of mesenchymal stem cells (MSCs), previous studies have shown that MSCs derived from mouse BM (BMMSCs) were difficult to manipulate as compared to MSCs derived from other species. The objective of this study was to find an alternative murine MSCs source that could provide sufficient MSCs. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: In this study, we described a novel type of MSCs that migrates directly from the mouse epiphysis in culture. Epiphysis-derived MSCs (EMSCs) could be extensively expanded in plastic adherent culture, and they had a greater ability for clonogenic formation and cell proliferation than BMMSCs. Under specific induction conditions, EMSCs demonstrated multipotency through their ability to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes. Immunophenotypic analysis demonstrated that EMSCs were positive for CD29, CD44, CD73, CD105, CD166, Sca-1 and SSEA-4, while negative for CD11b, CD31, CD34 and CD45. Notably, EMSCs did not express major histocompatibility complex class I (MHC I) or MHC II under our culture system. EMSCs also successfully suppressed the proliferation of splenocytes triggered by concanavalin A (Con A) or allogeneic splenocytes, and decreased the expression of IL-1, IL-6 and TNF-α in Con A-stimulated splenocytes suggesting their anti-inflammatory properties. Moreover, EMSCs enhanced fracture repair, ameliorated necrosis in ischemic skin flap, and improved blood perfusion in hindlimb ischemia in the in vivo experiments. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCES: These results indicate that EMSCs, a new type of MSCs established by our simple isolation method, are a preferable alternative for mice MSCs due to their better growth and differentiation potentialities