Characterisation of cytosolic prion protein-mediated putative cytotoxicity in neuronal cell lines

Prion diseases are a complex group of fatal neurodegenerative disorders with a broad host spectrum, which are characterised by strong neuronal cell loss, spongiform vacuolation and astrocytic proliferation. The molecular mechanisms of prion-mediated neurodegeneration are not yet fully understood. Recently, it has been proposed that neuronal cell death might be triggered by cytosolic accumulation of misfolded cellular prion protein (PrPC) due to impairment of proteasomal degradation. Cytosolic PrPC could result from either retro-translocation via the endoplasmatic reticulum-associated degradation system (ERAD) or abortive translocation of PrPC into the ER. Indeed, expression of cytosolic PrP (Cy-PrP) was shown to be neurotoxic both in vivo and in vitro. However, contradicting results on cytosolic PrP-mediated neurotoxicity in cultured cells have been reported. Cytosolic PrP–mediated cytotoxicity may play a central role in the pathogenesis of prion diseases. In order to investigate the molecular mechanisms of this process, a detailed analysis of N2a cells conditionally expressing cytosolic PrP (Cy-PrP) was performed in this study. The following results were obtained: First, Cy-PrP expression is not per se sufficient to trigger cytotoxicity in N2a cells independently of proteasome inhibition. Second, Cy-PrP is degraded with kinetics resembling the degradation of cell membrane-anchored full-length PM-PrP. In this process, the 20/26S proteasome was responsible for Cy-PrP degradation while the proteolysis of matured full length PM-PrP is not affected by the proteasomal system. Third, Cy-PrP accumulates in fine foci when expressed at high levels and co-localises with the cytosolic chaperone Hsc70 in EEA-1 positive endocytic vesicles. From these data it was proposed that the chaperone Hsc70 acts as a regulator for the controlled formation of amorphous Cy-PrP aggregates and their transport to endosomal vesicles. This Hsc70-dependent mechanism may confer protection to N2a cells against toxic accumulation of Cy-PrP in the cytosol.Prionenerkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, neuropathologisch charakterisiert durch spongiforme Vakuolenbildungen im Hirngewebe, den Verlust neuronaler Zellen sowie die verstärkte Proliferation von Mikroglia und Astroglia. Die molekularen Mechanismen für eine derartige Prionen-vermittelte Neurodegeneration sind jedoch nicht vollständig aufgeklärt. In jüngster Vergangenheit wurden Beobachtungen gemacht, die annehmen lassen, dass eine zytosolische fehlgefaltete Form des zellulären Prionproteins (PrPC) der Auslöser für solch einen neuronalen Zelltod sein könnte. Dabei wird angenommen, dass eine Beeinträchtigung des proteasomalen Proteolysesystems eine Ursache für diese zytosolische Akkumulation von PrP darstellt. Die Akkumulation von zytosolischem PrP ist entweder die Folge eines Rücktransports von unreifem nicht-nativ gefaltetem PrP aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), welches unter diesen Bedingungen nicht abgebaut wird (ER-assoziierter Abbau, ERAD) oder ist zurückzuführen auf einen unzureichenden post-translationalen ER-Import bei gesteigerter Genexpression. In der Tat wurde in vivo und in vitro ein zytotoxisches Potential für ein zytosolisch exprimiertes PrP (Cy-PrP) gezeigt. Mit Hilfe kultivierter Zelllinien wurden diesbezüglich jedoch widersprüchliche Ergebnisse publiziert, die nicht für eine generelle Toxizität des Cy-PrPs sprechen. Dennoch könnte eine Cy-PrP-vermittelte neuronale Toxizität eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von Prionenerkrankungen spielen. Um diesem Mechanismus detaillierter auf den Grund zu gehen, wurden in dieser Studie neuronale N2a Zellen etabliert, die Cy-PrP sowohl transient induzierbar als auch stabil exprimieren. Mit Hilfe dieses Zellmodells konnten folgende Beobachtungen gemacht werden: Erstens, die transiente Expression von Cy-PrP über einen Zeitraum von 24 h und 48 h war nicht ausreichend, um im signifikanten Maßstab Zelltod in neuronalen Zellen zu induzieren. Dazu wurde zum einen die Vitalität der Zellen mittels MTT-Test gemessen. Zum anderen wurde die Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) aus den Zellen bestimmt zur Abschätzung der Cy-PrP vermittelten Zytotoxizität. Um diese Daten zu untermauern wurde zusätzlich getestet, ob eine Cy-PrP Expression zu einer spezifischen Aktivierung der Caspase-3 führt, einem zentralen Parameter innerhalb der Apoptose-Signalwege. Auch hier konnte keine Cy-PrP spezifische Caspase-3-Aktivierung nachgewiesen werden. Um zelltyp-abhängige Effekte auszuschließen wurde das Cy-PrP in nicht-neuronalen Zellen exprimiert, zeigte jedoch auch hier keinen zytotoxischen Effekt in den MTT-Vitalitätstests. Auf Grund der postulierten biochemischen Ähnlichkeiten von Cy-PrP und PrPSc wurde das Cy-PrP im zweiten Teil der Arbeit bezüglich seiner Proteinase K-Resistenz, seiner Halbwertszeit und intrazellulären Proteolyse näher charakterisiert. Ersteres wurde ermittelt durch den Verdau der Zelllysate mit unterschiedlichen Protease K-Konzentrationen gefolgt von Immunoblotanalysen zur Detektion der resistenten Cy-PrP-Mengen. Im Gegensatz zum PrPSc, welches kontinuierlich von den als positive Kontrolle eingesetzten N2a58/22L-Zellen gebildet wird, wurde das Cy-PrP durch die Proteinase-K-Behandlung vollständig verdaut. Zur Bestimmung der Halbwertszeiten von Cy-PrP und dem vollständigen Prionprotein (PM-PrP) wurden Degradationsexperimente durchgeführt. Mit Hilfe der dazu durchgeführten Immunoblotanalysen konnte ein intrazellulärer Abbau des Cy-PrPs beobachtet werden. Dabei war die Abbaukinetik des Cy-PrPs vergleichbar mit der des PM-PrPs. Nähere Untersuchungen mit Hilfe des proteasomalen Inhibitors Epoxomicin zeigten, dass die Cy-PrP-Proteolyse Proteasom-vermittelt ist. Im Vergleich dazu erfolgte der Abbau des reifen, glycosylierten PM-PrPs unabhängig von der Inhibitorzugabe und war demzufolge nicht Proteasom-vermittelt. Drittens, obwohl die Cy-PrP-Proteolyse durch das Proteasom erfolgt, hatte die Überexpression von Cy-PrP keinen Einfluß auf die intrazelluläre Proteasomaktivität und das proteasomale Expressionslevel. Um zu untersuchen, ob eine Beeinträchtigung der Proteasomaktivität eine Cy-PrP-vermittelte Zytotoxizität auslösen kann, wurden MTT-Tests in Anwesenheit des spezifischen Proteasominhibitors Epoxomicin durchgeführt. Trotz Inhibition des Proteasoms konnte nach 24 stündiger Cy-PrP-Expression keine Cy-PrP-vermittelte Zytotoxizität detektiert werden. Viertens, intrazelluläre Lokalisationsstudien mit Hilfe von Fraktionierungs-experimenten und Immunofluoreszenzanalysen ergaben eine inhomogene intrazelluläre Verteilung des Cy-PrPs, charakterisiert durch starke Aggregat-ähnliche Detektionsmuster in den Immunofluoreszenzanalysen. Dieses Lokalisationsmuster wurde sowohl in den transient exprimierenden Zellen als auch in den stabilen N2a-Cy-PrP Zelllinien beobachtet. Kolokalisationsstudien mit verschiedenen Zellkompartment-spezifischen Markern ergaben keine ER- und Golgi-Lokalisation für das Cy-PrP. Dagegen wurde das PM-PrP wie erwartet Membran-ständig und im Golgi detektiert. Interessanterweise konnte hier gezeigt werden, dass die großen intrazellulären Cy-PrP-Akkumulationsherde mit endosomalen EEA-1 positiven Vesikeln und mit Hsc70, der konstitutiven Form des Hsp70, kolokalisierten. Dabei war zu beobachten, dass das zytosolische Hsc70 in den Mock-Kontrollen und PM-PrP-exprimierenden Zellen intrazellulär homogen verteilt war. Die Expression von Cy-PrP verursachte jedoch eine zelluläre Umverteilung von Hsc70, beobachtbar als Aggregat-ähnliches Detektionsmuster in den Immunofluoreszenzanalysen. Dabei hatte die Expression von Cy-PrP oder PM-PrP keinen Einfluß auf das Expressionslevel von Hsc70, analysiert in Immunoblotexperimenten. Fünftens, in dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal stabile Cy-PrP-exprimierende Zelllinien zu etablieren. Dabei wurden zwei verschiedene Parentalzelllinien verwendet – die neuronalen N2a Zellen und die PrP0/0 neuronalen Vorläufer-Zellen. Diese Zelllinien zeigten keine Anzeichen von Apoptose wie verringerte Proliferation oder Chromatinkondensation. In den PrP0/0 neuronalen Vorläufer-Zellen kolokalisierte das Cy-PrP ebenfalls mit endosomalen EEA-1 positiven Vesikeln und mit Hsc70. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass allein das Auftreten von zytosolischem PrP nicht primär den neuronalen Zelltod initiieren muß. Zusätzlich könnte die effiziente Entfernung des Cy-PrPs aus dem Zytosol durch einen gezielten Transport in endosomale Vesikel eine erfolgreiche Methode sein, um eine toxische zytosolische PrP-Akkumulation zu unterbinden, was letztendlich von Zelltyp zu Zelltyp in seiner Leistungsfähigkeit variieren kann. Die beobachtete Kolokalisation von Cy-PrP und Hsc70 in solchen endosomalen Vesikeln könnte ein erster Hinweis darauf sein, dass Hsc70 eine wichtige Regulatorfunktion bei der kontrollierten Entstehung von amorphen Cy-PrP Aggregaten und deren Transport in endosomale Vesikel übernimmt. Diese Hsc70-abhängige Translokation von Cy-PrP könnte einen wesentlichen Schutzmechanismus gegen eine toxische Akkumulation von Cy-PrP in N2a-Zellen widerspiegeln

Prospects for Top Physics at the LHC

The prospects for top quark physics at the LHC are reviewed, with an emphasis on early data measurements. Studies for both ATLAS and CMS are summarised, covering topics such as top-pair as well as single-top cross-section measurements, top for calibration, top mass measurement and top charge measurements

Orthografische Verarbeitung bei Kindern mit Lese- und/oder Rechtschreibstörung: Neurophysiologische Korrelate und Lernprozesse

Die Forschung zu den schulischen Lernstörung ging bisher von einem Störungskonzept, der Legasthenie, aus, mit dem die Probleme im Lesen und Rechtschreiben zusammengefasst wurden. Die aktuelle Forschung aber zeigte, dass sich drei Störungen schulischer Lernstö-rungen abgrenzen lassen, nämlich eine Lese-, eine Rechtschreib-, und eine Lese- und Recht-schreibstörung. Diese Unterteilung wurde sowohl in epidemiologischen Studien als auch in den Studien zu den Ursachen dieser Störungen bestätigt. Letztendlich unterscheidet auch das DSM-5 zwischen Lese- und Rechtschreibstörung. Unklar bisher aber ist, was sind die neu-rokognitiven und neurophysiologischen Korrelate, die diese Lernstörungsgruppen unter-scheiden. Es wird vermutet, dass die Probleme im Rechtschreiben (Rechtschreibstörung) und Lesen (Lesestörung) auf Unterschiede in der orthografischen Verarbeitung zurückzuführen sind. Um die Dissoziationen besser verstehen zu können, wurden Kinder mit isolierten Lese-, isolierten Rechtschreib- und kombinierten Lese- und Rechtschreibstörungen mit Kindern ohne Probleme im Schriftspracherwerb (Kontrollgruppe) sowohl in ihrer Leistung beim Ler-nen neuer Wörter (orthografisches Lernen) als auch hinsichtlich der neurophysiologischen Aktivierung bei der automatischen orthografischen Wortverarbeitung verglichen. Die Ergebnisse im Hinblick auf das orthografische Lernen zeigten, dass Kinder mit isolierter Lesestörung keine Schwierigkeiten im kurzzeitigen Merken und im Einspeichern orthografi-scher Repräsentationen im Langzeitgedächtnis hatten. Kinder mit Lesestörung zeigten aller-dings ein verlangsamtes Lesetempo, welches auf einen verzögerten Zugriff oder eine längere Verarbeitungsdauer der gespeicherten Repräsentationen zurückzuführen sein könnte. Kinder mit isolierter Rechtschreibstörung hingegen scheinen Probleme beim Einspeichern spezifi-scher Wortbilder inklusive der orthografischen Marker im Langzeitgedächtnis zu haben. Im Hinblick auf die automatische orthografische Verarbeitung von Wörtern zeigten die Kinder aller Gruppen den „word superiority effect“ (ein Buchstabe wird besser erkannt, wenn er zuvor in einem sehr kurz präsentierten Wort eingebettet ist im Vergleich zu einem Nichtwort) sowohl auf Verhaltens- als auch auf neurophysiologischer Ebene. Unterschiede zeigten sich bei der neurophysiologischen Aktivierung der N400-Amplitude (EKP-Komponente) hin-sichtlich der phonologischen Wortverarbeitung. Kinder mit isolierten Lesedefiziten zeigten keine Probleme in der phonologischen Wortverarbeitung (gleiche Aktivierungsunterschiede wie die Kontrollgruppe), während Kinder mit isolierten Rechtschreibdefiziten eine reduzierte Sensitivität bei der phonologischen Wortverarbeitung zeigten (keine Unterschiede in der N400-Aktivierung). Dissoziationen zwischen Lese- und Rechtschreibstörungen sind dem-nach mit Unterschieden sowohl im orthografischen Lernen als auch in der automatischen orthografischen Wortverarbeitung verbunden.Current research has shown that learning disorders can be distinguished between reading, spelling und combined reading and spelling disorders. Isolated reading and isolated spelling deficits are as frequent as combined reading and spelling disorders. It is unclear what underlying neurocognitive and neurophysiological deficits are likely to be associated with dissociations between reading and spelling. It is suggested that problems in spelling and reading are probably due to distinct deficits in orthographic word processing. To better understand these dissociations, children with isolated reading fluency deficits, isolated spelling deficits, and combined reading and spelling deficits were compared to children with age appropriate reading and spelling skills (controls), both in their performance in learning new words (orthographic learning) and in their neurophysiological activation of automatic orthographic word processing. The results in terms of orthographic learning showed that children with isolated deficits in reading had no problems in storing orthographic representations in long-term memory. The data suggest that the dysfluent reading of children with isolated reading fluency deficits is probably due to a disrupted or slowed down access to the stored intact representations. Children with isolated spelling deficits, on the other hand, seem to have problems in storing precise representations in long-term memory. With regard to automatic orthographic processing of words, the children of all groups showed a “word superiority effect” (a letter is better identified if it is embedded in a very briefly presented word in comparison to a nonword), both on the behavioral and the neuro-physiological level. Group differences occurred in the N400 activation regarding phono-logical processing. Children with isolated reading deficits showed no problems in phonological word processing (same differences in N400 activation as controls), while children with isolated spelling deficits seem to have a reduced sensitivity for phonological word processing (missing N400 activation differences). In sum, dissociations between reading and spelling problems are associated with differences, both in orthographic learning and automatic orthographic word processing

Re-evaluation of the LHC potential for the measurement of Mw

We present a study of the LHC sensitivity to the W boson mass based on simulation studies. We find that both experimental and phenomenological sources of systematic uncertainties can be strongly constrained with Z measurements: the lineshape is robustly predicted, and its analysis provides an accurate measurement of the detector resolution and absolute scale, while the differential cross-section analysis absorbs most of the strong interaction uncertainties. A sensitivity \delta Mw \sim 7 \MeV for each decay channel (W --> e nu, W --> mu nu), and for an integrated luminosity of 10 fb-1, appears as a reasonable goal

An example of beneficial use of variable-structure modeling to enhance an existing rocket model

Abstract This paper introduces a rocket model and discusses the advantages of refining it using a variable-structure approach to remodel critical parts. Both versions of the model are implemented in Modelica and were simulated using Dymola as simulation environment. The DySMo framework, which supports the simulation of variable-structure models in common simulation environments, was used to facilitate the redesign. The general benefits of the variable-structure approach are presented, and on the basis of the rocket model we present that simulation time and the data volume of the simulation can be reduced while maintaining the accuracy of the simulation results

Удосконалення мультисервісної мережі зв’язку з щільним хвилевим мультиплексуванням

Об'єкт дослідження: базова технологія в мультисервісній мережі. Мета роботи: збільшення пропускної спроможності мультисервісної мережі на основі технології DWDM за рахунок вдосконалення структурної схеми оптичної абонентської лінії зв’язку. Методи дослідження: теорія систем та мереж масового обслуговування, аналітичний метод дослідження. В першому розділі проведено аналіз та порівняння технологій спектрального ущільнення каналів, зокрема технології мультиплексування каналів по довжині хвилі та щільного хвильового мультиплексування. В спеціальній частині запропоновано технічне рішення для усунення проблеми постійно зростаючого браку смуги частот в оптичних лініях зв’язку. Проведено розробку структурної схеми абонентського пристрою оптичної абонентської лінії зв’язку. Показана перевага запропонованого пристрою перед вже існуючими пристроями. В економічній частині проведений розрахунок витрат на введення та налаштування вдосконаленої лінії зв’язку та розрахунки витрат на ремонт ліній зв’язку. Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що зменшена смуга оптичних довжин хвиль, що займає одна лінія. Розроблений пристрій збільшує пропускну спроможність цифрових багатоканальних систем передачі, призначених для роботи в мультисервісних мережа

Jet energy measurement with the ATLAS detector in proton-proton collisions at root s=7 TeV

The jet energy scale and its systematic uncertainty are determined for jets measured with the ATLAS detector at the LHC in proton-proton collision data at a centre-of-mass energy of √s = 7TeV corresponding to an integrated luminosity of 38 pb-1. Jets are reconstructed with the anti-kt algorithm with distance parameters R=0. 4 or R=0. 6. Jet energy and angle corrections are determined from Monte Carlo simulations to calibrate jets with transverse momenta pT≥20 GeV and pseudorapidities {pipe}η{pipe}<4. 5. The jet energy systematic uncertainty is estimated using the single isolated hadron response measured in situ and in test-beams, exploiting the transverse momentum balance between central and forward jets in events with dijet topologies and studying systematic variations in Monte Carlo simulations. The jet energy uncertainty is less than 2. 5 % in the central calorimeter region ({pipe}η{pipe}<0. 8) for jets with 60≤pT<800 GeV, and is maximally 14 % for pT<30 GeV in the most forward region 3. 2≤{pipe}η{pipe}<4. 5. The jet energy is validated for jet transverse momenta up to 1 TeV to the level of a few percent using several in situ techniques by comparing a well-known reference such as the recoiling photon pT, the sum of the transverse momenta of tracks associated to the jet, or a system of low-pT jets recoiling against a high-pT jet. More sophisticated jet calibration schemes are presented based on calorimeter cell energy density weighting or hadronic properties of jets, aiming for an improved jet energy resolution and a reduced flavour dependence of the jet response. The systematic uncertainty of the jet energy determined from a combination of in situ techniques is consistent with the one derived from single hadron response measurements over a wide kinematic range. The nominal corrections and uncertainties are derived for isolated jets in an inclusive sample of high-pT jets. Special cases such as event topologies with close-by jets, or selections of samples with an enhanced content of jets originating from light quarks, heavy quarks or gluons are also discussed and the corresponding uncertainties are determined. © 2013 CERN for the benefit of the ATLAS collaboration