異常血色素におけるタンパク質の構造変化と機能異常相関

金沢大学医療技術短期大学X線結晶解析によると、Hbの四次構造変化、すなわちR(relaxed)→T(tense)転移は、α_1-β_1とα_1-β_2のサブユニット接触面のうち、主にα_1-β_2接触面で起こるといわれている。このα_1-β_2接触面にアミノ酸変異が起こると、Hbの協同性が失われることは、この面が重要であることを裏付けている。しかし、個々のアミノ酸が四次構造変化にともなって、どのような状態変化を起こしているかについての知見は非常に乏しい。最近レーザー技術の発展により、高繰り返しで安定なUVレーザー光が得られるようになったこと、また弱いラマン線を高感度でキャッチする検出器が開発されたことにより、タンパク質の紫外光励起の共鳴ラマン(UVRR)の測定が可能になった。UVRRでは励起波長を選ぶことによって、アミド結合、Phe、Trp、Tyrなどの状態変化をそれぞれ選択的に解析できる。本研究では235nm励起によるUVRRでHbのR→T転移にともなうTrpとTyrの状態変化を調べた。HbのR→T転移にともないTrpのラマンバンドには主に強度の変化が、Tyrには波数のシフトがみられた。異常血色素Hb Hirose(β37Trp→Ser)のUVRRを測定することにより、DeoxyHb A中のβ37Trpのラマンスペクトルを抽出することに初めて成功した。それよりDeoxyHb Aにおけるβ37Trpは疎水的環境にあり強い水素結合を形成していることが示唆された。酸素結合にともなってこの状態に変化が起こり、R→T転移にともなう全Trpの変化の70%がこのβ37Trpによることが明らかとなった。また、Hb Hiroseのタンパク質の構造変化を円偏光二色性(CD)スペクトルにより調べ、機能と構造変化についても考察した。X-ray crystallographic studies have shown that the deoxy and liganded forms of hemoglobin (Hb) poseesee two distinct quaternary structures named T-and R-states, respectively. Cooperative oxygenation to Hb has been explained in terms of a reversible transition between the two quaternary structures upon partial ligation to the four hemes. Environmental changes of tyrosine (Tyr) and tryptophan (Trp) residues of Hb upon its T-to-R transition of quaternary structure was ivestigated with ultraviolet resonance Raman (UVRR) spectroscopy and circular dichroism (CD) . To characterize the spectral change of Trp beta37 at alpha_1beta_2 interface due to the quaternary structure transition, the UVRR spectra of Hb A were compared with the corresponding spectra of Hb Hirose in which Trp beta37 is replaced by serine (Ser) . Difference spectrum between deoxyHb A and deoxyHb Hirose gave rise to only Trp RR bands, which were reasonably ascribed to Trp beta37 in deoxyHb A.Comparison of the Hb A-Hb Hirose difference spectra in the oxy and deoxy states revealed that the oxygenation-induced changes of Trp RR bands arose mostly from Trp beta37 and the remaining minor part from Trp beta15, demonstrating that Trp beta37 plays a pivotal role in the quaternary structural change in Hb A.研究課題/領域番号:05670116, 研究期間(年度):1993 – 1994出典：研究課題「異常血色素におけるタンパク質の構造変化と機能異常相関」課題番号05670116（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-05670116/056701161994kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

ヘモグロビンにおけるヘム鉄の蛋白質による機能制御

金沢大学医薬保健研究域医学系ヘモグロビンの協同性は酸素結合型(R)から脱酸素型(T)への2つの蛋白質の構造転移により、その活性中心のヘム鉄の酸素親和性が変わることによると考えられている。本研究ではどのような蛋白質の構造変化がヘム鉄に直接影響を与えるのかについて、特に蛋白質の変化を近紫外円二色性(CD)および紫外共鳴ラマン散乱(UVRR)により追求した。蛋白質のどの部分がその構造転移の鍵をにぎっているかを明らかにするために、以下の3点について主としてヘモグロビンの変異体を用いて研究を行った。(1)紫外共鳴ラマン散乱によるヘモグロビンの四次構造変化に関与するチロシン残基の同定:今回はα1β2サブユニット界面に存在するTyr残基、α140、β35およびβ145Tyrの寄与をそれらの変異体を用いて調べたところ、α140Tyrは波数シフトと強度変化の両方に、β145Tyrは強度変化に関与したが、β35Tyrには変化がなかった。この成果はBiochemistryに発表した。(2)近紫外CDにおけるT-stateマーカーバンドの由来:DeoxyHbにのみ見られる287nmの負のCDバンドはT-stateマーカーとして知られている。このCDバンドがどのアミノ酸残基に由来するのかについて追求した。ここではHb Hirose(β37Trp->Ser)とHb Rouen(α140Tyr->His)の2つの変異体を用いて調べた結果、α140Tyrは30%、β37Trpの寄与は26%であった。この成果はポーランドで開かれた第7回CDに関する国際学会(平成11年8月25-29日)にて発表し、Chirarityに投稿して平成12年1月27日付で受理され、現在印刷中である。研究課題/領域番号:11116209, 研究期間(年度):1999出典：「ヘモグロビンにおけるヘム鉄の蛋白質による機能制御」研究成果報告書　課題番号11116209（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11116209/)を加工して作

異常血色素における機能異常とタンパク質の高次構造変化との関連

金沢大学医学部235nm励起紫外共鳴ラマン(UVRR)では主にチロシン(Tyr)とトリプトファン(Trp)に関する情報が得られる。ヘモグロビン(Hb)がdeoxy形(T)からCO形(R)に変わるとき、Trpでは主に強度変化が、Tyrでは波数シフトと強度変化の両方が起こった(J.Biol.Chem.,1995)。UVRRのTyrやTrpの変化とdeoxyHbの負のCD帯の出現にはサブユニット接触面(α_1β_2)の芳香族アミノ酸の関与が考えられるので、この部位のTyrやTrpが他のアミノ酸に変異した異常Hbおよび遺伝子工学的手法による人工変異Hbを用いて測定しその影響を調べた(J.Mol.Struct.,1966)。UVRRでは蛋白中のTyr残基を浮き彫りにしてその構造変化を明らかに出来るので、シグナル伝達やがん遺伝子などに関係するチロシンキナーゼによるチロシンリン酸化をヘモグロビン研究と平行して研究対象とした(J.Raman Spectrosc.,1998)。また、ヘモグロビンのT→R転移における構造変化をNOHbを用いて検索した。UVRRにみられる変化がリガンド結合そのものに由来するのか、真に四次構造変化に起因するのかを知る目的である。NOHbはリガンド結合の有無に関係なく、アロステリックエフェクター(IHP)の添加でT構造に変換することが知られているからである。その結果、UVRRでみている変化は真に四次構造変化を反映しているという興味ある結果を得た(現在、論文投稿中)。It has been recently reported that resonance Raman spectra excited in the UV region at 200-240 can explore the environmental and hydrogen bonding changes of tryptophan (Trp) and tyrosine (Tyr) residues of proteins. we have demonstrated here the quaternary-structural dependent features for Tyr and Trp residues in alpha_1beta_2 interface of hemoglobin (Hb) from 235-nm excited UV resonance Raman (UVRR) spectra. Deoxy Hb A (T-form) showd a UVRR spectrum distinctly different from those of the ligated Hbs (R-form) including osyHb, COHb and NOHb.To characterize the spectral changes of Trp-beta37 at alpha_1beta_2 interface due to the quaternary structure transition, the UVRR spectra of Hb A were compared with the corresponding spectra of Hb Hirose (Trp-beta37->Ser). Comparison of the Hb A - Hb Hirose difference spectra in oxy and deoxy states revealed that the oxygenation- induced changes of Trp RR bands arose mostly from Trp-beta37.The UVRR spectral contribution of alpha42Tyr, Which is located in the "swhitch" region of the alpha_1beta_2 interface and forms an H-bond with the carboxylate side chain of beta99 Asp only in the T-state, was deduced for each of the deoxy- and CO-forms by subtracting the spectra of Hb alpha Y42H from those of Hb A.This suggested that alpha42Tyr is responsible for the frequency shift of Y8a (1617cm^) and Y9a (1179cm^) of the Tyr RR bands of Hb alphaY42H upon quaternary structure change are alike.The extent of the oxidation of Hb M Sakatoon and Hb M Boston in the patients blood was determined by measurement of the intensity of EPR signal at g=6.0 for the normal subunits, g=6.7for the mutant subunit of Hb M Saskatoon, and g=6.3 for those of Hb M Boston. About 50% and 76% of mutant subunits in Hb M Boston and Hb M Sakatoon remained reduced in the fresh blood, respectively.研究課題/領域番号:07670140, 研究期間(年度):1995 – 1997出典：研究課題「異常血色素における機能異常とタンパク質の高次構造変化との関連」課題番号07670140（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-07670140/076701401997kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

ヘム蛋白質における配位子と周辺アミノ酸との特異的相互作用

金沢大学医療技術短期大学部ヘム蛋白質における配位子と周辺アミノ酸との特異的相互作用を調べるにあたって、ヘム蛋白質としてヘモグロビンを選びその一酸化炭素(CO)の結合に周辺アミノ酸の与える影響を、ヘム周辺アミノ酸変異異常ヘモグロビンを用いて調べた。COの結合状態は共鳴ラマン分光及びフェムト秒赤外分光により調べた。以下に今年度得られた結果について述べる。1)共鳴ラマン分光による解析:COの結合に由来するラマン線は、CO伸縮振動(ν_),Fe-CO伸縮振動(ν_),Fe-C-O変角振動(δ_)の3つである。577cm^のラマン線が基本音であるか倍音とするかあるいは結合音とするか議論のあるところである。COの同位体を使って丁寧に調べると、370cm^に新しく同位体によりジグザグパターンを示すラマンバンドが見つかった。これを基本音とすると、従来の577cm^にみられるラマンバンドは結合音と見做すことができる。シトクロムオキシダーゼでも同様な結果が得られたので、この性質はヘム周辺アミノ酸にあまり依存しないことが分かった(この内容の論文はJ.Phys.Chem.に受理され、1994年に印刷予定)。2)フェムト秒赤外分光:ヘム周辺アミノ酸変異ヘモグロビンHb M BostonのCO伸縮振動(ν_)は正常Hbに比べて20cm^も低波数にシフトし、CO結合機能や結合様式が異なることが予想された。しかし、フェムト秒赤外分光で調べたところ正常Hbと同じという予期に反した結果となり、結合様式が違うのではなくヘム周辺アミノ酸のhydrophobisityがCOの振動モードに影響与えていると考えた方がよさそうである。(Biochemistry、1993年に掲載)。研究課題/領域番号:05209210, 研究期間(年度):1993 – 1994出典：研究課題「ヘム蛋白質における配位子と周辺アミノ酸との特異的相互作用」課題番号05209210（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-05209210/）を加工して作

Hemoglobin Yakima(B99ASP→His)とHemoglobin K empsey(B99ASP→Asn)に対するInosital hexaphosphateの効果

金沢大学医療技術短期大学部研究課題/領域番号:X00095----968020, 研究期間(年度):1974出典：「Hemoglobin Yakima(B99ASP→His)とHemoglobin K empsey(B99ASP→Asn)に対するInosital hexaphosphateの効果」研究成果報告書　課題番号：X00095----968020（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-X00095----968020/）を加工して作

Electron identification using the TOPAZ detector at TRISTAN

We present an electron-identification method using the time-projection chamber and the lead-glass calorimeter in the TOPAZ detector system. Using this method we have achieved good electron identification against hadron backgrounds over a wide momentum range in the hadronic events produced by both single-photon exchange and two-photon processes. Pion-rejection factors and electron efficiencies were 163 and 68.4\% for high-$P_T$ electrons and 137 and 42.7\% for low-$P_T$ electrons in the single-photon-exchange process, and 8600 and 36.0\% for the two-photon process, respectively.Comment: 32 pages, latex format (article), 24 figures, submitted for publication

ANTITUMOUR EFFECT OF VALPROIC ACID AGAINST SALIVARY GLAND CANCER

Salivary gland cancer (SGC) has a comparatively poor prognosis and is prone to frequent recurrence and metastases. Therefore, the development of more effective chemotherapy against SGC is desirable. The aim of the present study was to investigate the antitumour effects of valproic acid (VPA) against SGC in vitro and in vivo. Two human SGC cell lines (HSY and HSG cells) were used in the present study. The effects of VPA on the proliferation of SGC cells in vitro were assessed by MTT assay. Cancer cells treated with VPA were subjected to cell cycle analysis by flow cytometry. In addition, the expression levels of p21 and p27 were examined by real-time RT-PCR to identify the mechanisms of the antitumour effect of VPA on SGC. The effects of VPA on cancer growth in vivo were evaluated in a xenograft model. VPA inhibited the proliferation of SGC cells in a dose-dependent manner in vitro. Degenerated cancer cells were observed at high concentrations of VPA. In the cell cycle analysis, VPA induced cell-growth inhibition and G1 arrest of cell cycle progression in both cancer cell lines in a time-and dose-dependent manner. VPA markedly upregulated the mRNA expression levels of both p21 and p27 in both SGC cell lines in a time-dependent manner. In the xenograft model experiment, VPA treatment markedly inhibited the growth of salivary gland tumours when compared with the growth of the untreated controls. VPA may be a valuable drug in the development of better therapeutic regimens for SGC

Tonic B cell activation by Radioprotective105/MD-1 promotes disease progression in MRL/lpr mice

Toll-like receptors (TLRs) have a crucial role in sensing microbial products and triggering immune responses. Recent reports have indicated that TLR7 and TLR9 have an important role in activating autoreactive B cells. In addition to TLR7 and TLR9, mouse B cells express TLR2, TLR4 and structurally related Radioprotective105 (RP105). We have previously shown that RP105 works in concert with TLR2/4 in antibody response to TLR2/4 ligands. We here report that B cells are constitutively activated by TLR2/4 and RP105. Such B cell activation was revealed by the γ3 germ line transcript and serum IgG3 production, both of which were impaired by the lack of RP105 or TLR2/4. Serum IgG3 was not altered in germ-free or antibiotics-treated mice, suggesting that the microbial flora hardly contributes to the continuous activation of B cells. The lack of RP105-dependent B cell activation ameliorated disease progression in lupus-prone MRL/lpr mice. RP105−/− MRL/lpr mice showed less lymphoadenopathy/splenomegaly and longer survival than MRL/lpr mice. Whereas glomerulonephritis and auto-antibody production were not altered, improvement in blood urea nitrogen and lower incidence of renal arteritis indicated that renal function was ameliorated in the absence of RP105. Our results suggest that RP105-dependent tonic B cell activation has a pathogenic role in MRL/lpr mic