Estudio de la inmunogenicidad y mecanismos de muerte celular en nuevas terapias antitumorales. Aplicación al mieloma múltiple

En la investigación oncológica, el estudio de los mecanismos moleculares de muerte celular provocados por la quimioterapia es esencial no sólo para llegar a comprender los mecanismos de acción inherentes de estos fármacos, sino también para idear, optimizar y mejorar nuevos enfoques terapéuticos que permitan atajar las tan temidas recaídas. Además, durante los últimos años, la inmunoterapia ha irrumpido en la clínica como un tratamiento que brinda de una cierta esperanza a los pacientes con cáncer. Hoy en día, los tratamientos antitumorales utilizados o en desarrollo son capaces de inducir muerte celular mediante distintos mecanismos como la apoptosis, necroptosis, muerte celular inmunogénica (ICD), catástrofe mitótica, entre otras. Nuestro objetivo durante este trabajo ha sido estudiar los diferentes mecanismos de muerte celular inducidos por fármacos antitumorales actuales o de reciente introducción en la clínica, así como explorar la naturaleza inmunogénica subyacente a dichos tipos de muerte celular.Por un lado, se ha estudiado la contribución de la catástrofe mitótica en la inducción de muerte celular por agentes antimitóticos, así como los mecanismos de muerte accionados cuando dichos fármacos se utilizan en combinación con miméticos de BH3. Los resultados mostraron la existencia de una gran variabilidad inter- e intraindividual en los comportamientos y destinos celulares en respuesta a los distintos compuestos antimitóticos (barasertib, alisertib, vincristina y docetaxel). No obstante, la combinación de los distintos compuestos antimitóticos ensayados con miméticos de BH3 mostró una potenciación de la citotoxicidad en líneas celulares tumorales adherentes, siendo la muerte celular experimentada dependiente de caspasas y de Bax y Bak. En cuanto al papel de la familia de Bcl-2 en la muerte inducida por estos fármacos, los datos parecen indicar que los miembros anti-apoptóticos de esta familia contribuyen de forma cooperativa y acumulativa. Además, a pesar de que se trata un tema bajo debate, los experimentos con microscopía de fluorescencia en time-lapse sugieren que la duración del arresto mitótico influye en el destino ante dicho bloqueo. Cuando se combinó los compuestos antimitóticos con el mimético de BH3, ABT-737, se aceleraba la muerte celular y aumentaba el porcentaje de células que sucumbían durante la mitosis, especialmente en aquellas combinaciones donde el arresto mitótico era más prolongado. En el caso particular del inhibidor de aurora-B (barasertib), la potenciación de la muerte celular cuando se combinaba con ABT-737 sigue un mecanismo molecular diferente. El tratamiento con barasertib indujo marcadores de senescencia en diversas líneas celulares tumorales y la administración posterior de ABT-737 sensibilizaba de forma efectiva a dichas células induciendo una potente respuesta citotóxica. Por otro lado, en este trabajo se ha estudiado la inmunogenicidad y los mecanismos de muerte celular inducidos por la combinación de inhibidores del proteasoma con inhibidores de autofagia o compuestos inductores de estrés en el retículo endoplasmático en diversos modelos de mieloma múltiple. A pesar de que las terapias actuales han conseguido extender la esperanza de vida de esta enfermedad, sigue siendo una neoplasia incurable. En concreto, aunque los inhibidores de proteasoma han demostrado una validada eficacia clínica, la resistencia a estos fármacos sigue siendo recurrente y abarca la mayoría de las recidivas. Esta situación por tanto exige que se diseñen y estudien nuevos esquemas terapéuticos para abordar las recaídas. Así, en un trabajo previo del grupo se demostró la capacidad del inhibidor de autofagia cloroquina para potenciar la muerte celular inducida por carfilzomib. Durante este trabajo, se ha logrado observar también una intensificación similar de la muerte celular en las diferentes líneas celulares humanas y murinas analizadas. Además, la capacidad citotóxica mejorada de esta combinación también se ha constatado en una amplia colección de muestras primarias de médula ósea aisladas de pacientes con mieloma múltiple. De manera similar a lo que ocurre con la cloroquina, también hemos observado que el DBeQ, inhibidor de VCP/p97, también aumenta notablemente la muerte celular inducida por carfilzomib tanto en líneas celulares de MM como en células de mieloma primarias aisladas de la médula ósea de pacientes con esta enfermedad. Además, nuestros resultados indican que las combinaciones de carfilzomib con CLQ o DBeQ no sólo potencian, sino que también aceleran la muerte celular. Sin embargo, el mecanismo de acción por el cual se provoca dicha potenciación no se ha aclarado completamente. Los resultados de este trabajo mostraron que estos tratamientos aumentaban la expresión de varios marcadores de la respuesta a estrés en el retículo. No obstante, dicha respuesta, dependía estrechamente del tiempo y variaba sustancialmente entre las distintas líneas celulares de mieloma. La familia Bcl-2 ocupa una posición trascendental en las respuestas mediadas por estrés en el ER. A este respecto, nuestros datos revelaron una acumulación temprana transitoria de diversos miembros tanto anti- como proapoptóticos de esta familia (Mcl-1, Bim, PUMA y en menor medida NOXA). No obstante, nuestros datos mostraron que la línea celular deficiente para Bim sólo ofrecía una protección parcial contra la muerte celular inducida por los fármacos utilizados. Por lo tanto, su deficiencia podría estar compensada por otros miembros de BH3 capaces de desencadenar la muerte celular tras el tratamiento farmacológico. Por otro lado, aunque todavía no se conoce con exactitud el mecanismo molecular responsable de la muerte celular inducida por estrés en el ER, existen pruebas de la participación tanto de la vía de los receptores mortales como de la vía intrínseca de la apoptosis. Para instigar la muerte celular por la vía canónica, se requiere la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP) inducida por la oligomerización de Bax y Bak. Sin embargo, nuestros datos han demostrado la capacidad de las combinaciones de fármacos utilizadas de inducir la muerte celular en células deficientes en Bax y Bak. Así mismo, la muerte celular inducida por las combinaciones basadas en carfilzomib era dependiente de caspasas en la mayoría de las líneas celulares analizadas, aunque la contribución relativa de cada miembro de esta familia variaba con las diferentes líneas celulares utilizadas. Aunque precisa de un estudio más detallado, los datos obtenidos en este trabajo parecen indicar que la autofagia no juega un papel principal en la potenciación ejercida por la cloroquina sobre la muerte inducida por carfilzomib en nuestros modelos experimentales. En su lugar, los datos apuntan a que la cloroquina pueda ejercer de modulador alostérico sobre el proteasoma potenciando la inhibición de este cuando se utiliza en combinación con carfilzomib. En cuanto al estudio de la capacidad inmunogénica de estos tratamientos, se observó que in vitro, las combinaciones de fármacos eran capaces de inducir la expresión de diversas señales inmunogénicas (expresión de ecto-CRT, Hsp70 y BiP), así como la maduración de células dendríticas cuando estas eran coincubadas con restos apoptóticos de células tratadas con las formulaciones ensayadas. Sin embargo, las respuestas in vivo en los experimentos de vacunación en el modelo ortotópico de mieloma murino MOPC315.BM mostraron que la muerte celular provocada por la combinación de carfilzomib con cloroquina no proporcionaba un efecto protector contra el desarrollo de la enfermedad. Tan solo cuando la combinación de fármacos utilizada para tratar las células de mieloma contenía el inhibidor general de caspasas zVAD-fmk, se consiguió retrasar de forma débil el desarrollo del mieloma. Tal y como apuntan algunos estudios, esto podría indicar que las caspasas juegan un papel en la inmunogenicidad de la muerte celular. A la vista de nuestros datos, la emisión de DAMPs por sí misma podría no ser suficiente para provocar respuestas inmunitarias activas contra el cáncer. De hecho, se considera igualmente decisivo los mecanismos subyacentes involucrados en la recepción, transmisión y respuesta de las células inmunes a estas señales de peligro, así como la propia naturaleza inmunosupresora de esta enfermedad. Una de las razones detrás de la disfunción inmune observada en el mieloma múltiple está mediada por la regulación negativa ejercida por las proteínas inhibidoras del punto de control como el eje PD-1/PD-L1. Sin embargo, ni el tratamiento individual con anticuerpos monoclonales dirigidos contra los inhibidores del punto de control (anti-PD1), ni su combinación con la formulación de vacunación antes mencionada, extendían significativamente la supervivencia de los ratones. Es posible que redes moleculares mas complejas estén involucradas en la generación de una respuesta inmune antitumoral efectiva en la enfermedad de mieloma.Por último, cada vez se está consolidando más la idea de que los DAMPs y los procesos moleculares relacionados con la muerte celular inmunogénica puedan servir como una fuente de biomarcadores pronósticos en pacientes con cáncer. En este trabajo hemos demostrado por primera vez que las células de mieloma en muestras de médula ósea aisladas de pacientes con discrasias de células plasmáticas, muestran niveles elevados de ecto-CRT en su superficie. Además, aunque se observó una gran variabilidad interindividual, nuestros datos sugieren que los niveles de ecto-CRT parecen aumentar con la progresión de la enfermedad. Este hallazgo junto con el hecho de que los pacientes con un perfil citogenético alterado mostraron niveles aumentados de ecto-CRT y que la exposición a la CRT aparentemente no está influenciada por la quimioterapia, puede apuntar a la transformación maligna como el instigador principal de la expresión aumentada de este DAMP. Así mismo el análisis del microambiente en la médula ósea de estos pacientes mostró que los pacientes con niveles altos de ecto-CRT exhibían un perfil de células T alterado, con ratios bajos de células T CD4+/CD8+ consecuencia de una menor frecuencia de linfocitos T CD4+ y un mayor número de células T CD8+. Además, también presentaban un mayor número de células NK, mDC, pDC y Tregs, así como una mayor actividad en el eje PD-1/PD-L1. Así, nuestros datos sugieren que los pacientes con una mayor expresión de este DAMP, poseen rasgos inmunológicos reminiscentes de un microambiente medular óseo asociado a un estado inmunitario debilitado y comprometido, lo que podría traducirse en un mal resultado clínico en el contexto de la enfermedad. De hecho, el grupo de pacientes con un perfil de expresión de ecto-CRT aumentado exhibieron significativamente un menor tiempo medio de progresión de la enfermedad, desarrollaban con mayor frecuencia plasmacitomas extramedulares, habían sido tratados con un mayor número de líneas de tratamiento y albergaban un perfil citogenético de alto riesgo. Todo ello sugiere que la elevada expresión de ecto-CRT en las células de mieloma de estos pacientes está relacionada con una mayor malignidad, un microambiente inmunitario en la médula más deficiente y con un peor pronóstico clínico.<br /

Estudio de la apoptosis inducida por el inhibidor de Farnesil-Transferasas BMS-214662, APO2l/Trail e interferón alfa en el mieloma múltiple humano. Aplicaciones terapeúticas

El trabajo recogido en esta Tesis pretende contribuir a una mejor caracterización de los mecanismos mediante los cuales diferentes agentes terapeúticos BMS-214662, Apo2L/TRAIL e Interferón-alfa) en líneas celulares de mieloma múltiple (MM) y en células plasmáticas tumorales extraídas de pacientes de mieloma. El MM, como su propio nombre indica, es un "oma" o tumor que afeca a la "myelo" médula, y que actualmente continúa siendo incurable. La gran heterogeneidad existente entre los pacientes en cuanto al grado de afectación, la evolución de la enfermedad, la respuesta a los tratamientos... obstaculizan la obtención de terapias eficaces.Se hace necesaria una búsqueda de nuevos tratamientos, la caracterización de los mecanismos apoptóticos que inducen y de los parámetros que condicionan la sensibilidad de las células a dichos agentes, todo ello, con el objetivo de diseñar una terapia más efectiva, individualizada y racional.<br /

Análisis del mecanismo de acción de nuevos fármacos para el posible tratamiento de neoplasias hematológicas. Efecto del inhibidor de CK2, CX-4945, en células de mieloma múltiple

La proteína Ser/Thr quinasa CK2 se conoce que está implicada en varios procesos celulares como el ciclo celular, apoptosis y proliferación. Se ha estudiado que la inhibición de CK2 inducida por una molécula recientemente descubierta, CX-4945, muestra efectos anti-proliferativos y pro-apoptóticos en diferentes canceres, incluidos en mieloma múltiple. El MM es una neoplasia hematológica que afecta a las células B plasmáticas, la cual sigue siendo incurable. En este trabajo se analizó, sobre varias líneas celulares de mieloma múltiple, la capacidad de inducción y el mecanismo de muerte celular y la combinación con un inhibidor del mTOR. Los resultados mostraron que CX-4945 induce apoptosis en todas las líneas de MM analizadas, a partir de las 8h de incubación, y que todas ellas, excepto MM1.S, eran sensibles en grado variable al inhibidor de caspasas, Z-VAD-fmk. La apoptosis inducida por el inhibidor de CK2, en la línea MM.1S, mostró que era independiente de caspasas, mientras que en las líneas RPMI 8226 y U266, fue dependiente de caspasas, y en concreto se observó que la caspasa-8, era la caspasa iniciadora. En esta última línea celular aunque expresaba niveles significativos de DR4 y tras el tratamiento con CX-494,5 se inducía la expresión de TRAIL y FasL, la unión de estos a sus receptores mortales específicos no contribuían a la muerte inducida por el fármaco. CX-4945 inducía exposición de PS y caída del potencial mitocondrial y estos hechos no fueron completamente inhibidos por la sobreexpresión de Bcl-xL y Mcl-1 en células RPMI 8226. La necroptosis, necrosis programada, podría contribuir a la muerte inducida por el CX-4945 en las líneas celulares MM.1S y NCI-H929. El inhibidor de mTOR, PP242, disminuye la acción citotóxica del CX-4945 en las líneas celulares de mieloma, U266 y NCI-H929

Visualización de las interacciones entre proteínas de la familia BCL-2 mediante BIFC en células vivas

La apoptosis es un proceso esencial para mantener la homeostasis tisular y fallos en su regulación dan lugar a patologías, como procesos tumorales. El tratamiento actual de muchos tumores se basa en drogas citotóxicas que inducen muerte celular por la ruta mitocondrial de la apoptosis. Las señales desencadenadas por estos agentes convergen en la mitocondria y producen la liberación de factores apoptogénicos como el citocromo c que junto a la proteína Apaf-1 forma el complejo apoptosoma [1], capaz de activar la caspasa 9 iniciadora, que a su vez activa a las caspasas ejecutoras 3 y 7 las cuales llevarán a cabo la proteolisis de distintos sustratos celulares. Otro factor apoptogénico es AIF (Factor Inductor de Apoptosis), capaz de causar la condensación de cromatina independientemente de la acción de las caspasas [2]. La fase inicial de la ruta intrínseca de la apoptosis está regulada por las proteínas de la superfamilia Bcl-2 [3]. Dentro de esta superfamilia se encuentran proteínas antiapotóticas (Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL), proapoptóticas multidominio (Bak, Bax) y proapoptóticas sólo-BH3 (Bim, PUMA, Noxa, Bik, Bid), que solamente comparten con el resto de miembros el dominio de homología BH3. Las interacciones entre los miembros de esta familia regulan la activación de las proteínas Bak y Bax y posterior permeabilización de las membranas mitocondriales. Sin embargo, no se ha podido caracterizar completamente el mecanismo molecular por el que ocurre esta activación ni cómo las moléculas efectoras oligomerizan para llevar a cabo la permeabilización de las membranas. Existe un modelo de activación indirecta que propone que las proteínas antiapoptóticas actúan neutralizando a Bak y Bax, y que las proteínas sólo-BH3 que se inducen por estímulos apoptóticos, cuando se unen a las antiapoptóticas liberan a las moléculas efectoras activas [4, 5]. Otro modelo totalmente opuesto defiende la capacidad de ciertas proteínas sólo-BH3, denominadas activadoras y entre las que se ha propuesto a Bim, Bid y más recientemente PUMA y Noxa, de unirse de manera directa a Bak y Bax y causar su activación, cuando son liberadas de las antiapoptóticas por unión a éstas de los miembros sólo-BH3 sensibilizadores (Bad, Bik) [6, 7]. Datos previos de nuestro laboratorio muestran que la presencia de las proteínas Bak y Bax es esencial para la sensibilidad de las células a estímulos apoptóticos [8]. El trabajo con neoplasias hematológicas ha permitido observar que la apoptosis inducida por fármacos antitumorales hace aumentar los niveles de proteínas proapoptóticas como PUMA [9] o Bim [10]. También se ha visto el aumento de expresión de Bim tras el tratamiento con glucocorticoides, que hace exceder la capacidad de bloqueo de dicha proteína por Mcl-1 [11], quedando por lo tanto moléculas de Bim libres para activar a proteínas efectoras. El objetivo principal de mi trabajo de tesis doctoral ha sido estudiar las interacciones entre las proteínas de la familia Bcl-2, mediante la técnica de Complementación de Fluorescencia o BiFC. Esta técnica se basa en la formación de complejos fluorescentes por asociación de dos fragmentos de una proteína fluorescente cuando éstos se encuentran suficientemente próximos debido a la interacción de dos proteínas a las que dichos fragmentos se encuentran fusionados [12, 13]. En la literatura existen varios trabajos sobre las interacciones entre miembros de la familia Bcl-2. Sin embargo, la mayoría de datos se han obtenido con péptidos sintéticos y en sistemas libres de células. Mediante esta técnica, hemos podido caracterizar una serie de interacciones empleando las proteínas enteras y en modelos celulares. Además, esta técnica permite estudiar interacciones débiles o transitorias, difícilmente detectadas por otras técnicas. Hemos utilizado los vectores pBiFC-VN173 (que contiene el fragmento amino de la proteína Venus) y pBiFC-VC155 (con el fragmento carboxilo de la misma proteína fluorescente). Hemos generado un primer conjunto de proteínas de fusión de manera que los cDNA correspondientes a las proteínas Bim, PUMA, Noxa, Bak y Bax se han fusionado al fragmento VN173 y las proteínas Bak, Bax, Mcl-1 y Bcl-XL se fusionaron al fragmento VC155. Además, hemos generado una serie de mutantes de delección del dominio BH3 en las proteínas Bim, PUMA, Bak y Bax, de la primera hélice alfa en Bak y Bax y un mutante de sustitución de un aminoácido del dominio BH3 de Noxa (NoxaL29E), para evaluar la implicación de estas regiones de las proteínas en las interacciones con las distintas parejas. Hemos optimizado las condiciones de transfección de células HeLa y HCT116 con Lipofectamina y hemos evaluado en todos los casos los niveles de expresión de las proteínas de fusión respecto a las endógenas. Hemos empleado un tercer vector que contiene la proteína mRFP que nos ha servido de control interno de transfección. De esta manera, hemos podido calcular por citometría de flujo el porcentaje de células que presentan complejos fluorescentes así como la intensidad media de fluorescencia de la señal de BiFC respecto de la de mRFP. También hemos analizado la localización subcelular de los complejos por microscopía confocal y en determinados casos se ha analizado la formación de los complejos a lo largo del tiempo por microscopía de ¿time-lapse¿. Los resultados se han confirmado utilizando un segundo conjunto de vectores, en los que se ha intercambiado el fragmento (VN o VC) al cual se encuentra fusionada cada proteína. Por otra parte, se ha evaluado la influencia de la posición donde se fusiona el fragmento de la proteína fluorescente en algunas proteínas. Para ello se han generado líneas estables por infección retroviral derivadas de HeLa que sobreexpresan las proteínas EYFP-Mcl-1, Mcl-1-EYFP, EYFP-Bcl-XL y Bcl-XL-EYFP y se han realizado transfecciones transitorias para las fusiones EYFP-Bax y Bax-EYFP. El análisis por microscopía confocal ha permitido ver que solamente la localización de Bcl-XL se encuentra alterada cuando tiene su extremo carboxilo bloqueado. Por ello, se generó un nuevo vector que contiene la fusión VC155-Bcl-XL. Nuestros resultados indican que las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL se unen preferentemente a las proteínas sólo-BH3 Bim, PUMA y Noxa, interacción requiere la presencia del dominio BH3 de las segundas. También se ha podido detectar interacción de los miembros antiapoptóticos con Bak y Bax aunque en menor porcentaje de células y con complejos de menor intensidad de fluorescencia y se ha visto la implicación de los dominios BH3 de las segundas en estas interacciones. Cabe destacar que además hemos podido detectar la interacción de las proteínas sólo- BH3 Bim, PUMA y Noxa tanto con Bak como con Bax, lo cual apoyaría la capacidad de éstas de activar a las segundas por unión directa, un tema muy debatido en la literatura. Es interesante mencionar que los estudios de microscopía confocal y de ¿time-lapse¿ han revelado la formación de estos complejos en células que posteriormente adquieren fenotipo apoptótico. Los complejos Bim/Bax aparecen inicialmente en el citosol y se translocan a continuación a las mitocondrias. Nuestros resultados además, confirman la importancia del dominio BH3 de las proteínas sólo-BH3 a la hora de interaccionar con las proteínas multidominio Bax y Bak, viéndose la formación de los complejos fluorescentes significativamente reducida al deleccionar o modificar esta región de la proteína. Hemos obtenido también resultados interesantes acerca de la zona en la que las proteínas Bim, PUMA y Noxa se unen a Bak y Bax. Nuestros datos indican que la primera hélice de Bax es el lugar de unión de las proteínas sólo-BH3, coincidiendo con datos publicados anteriormente [14, 15], mientras que tanto esta región como el dominio BH3 de Bak son necesarios para estas interacciones. Hemos obtenido datos sobre la dimerización de Bak que indican la importancia de su dominio BH3 en este proceso, mientras que para Bax nuestros resultados sugieren la implicación de su primera hélice alfa. Estos datos ponen de nuevo en evidencia diferencias importantes en el proceso de activación y oligomerización de estas proteínas. Además, hemos generado líneas estables por infección retroviral derivadas de HeLa que sobreexpresan las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL. Hemos comprobado por citometría de flujo que las interacciones de las proteínas sólo-BH3 con Bak/Bax se ven reducidas tanto en porcentaje de células como en intensidad de los complejos y las imágenes de microscopía time-lapse han permitido comprobar que existe un retraso en la formación de estos complejos. Datos preliminares obtenidos mediante la técnica BiFC multicolor, han permitido observar la existencia de una competición entre proteínas antiapoptóticas y Bak/Bax por unirse a las proteínas "solo-BH3"

Mecanismo de la apoptosis inducida por el inhibidor de quinasas sorafenib en células de mieloma humano

El mieloma múltiple (MM) es la segunda neoplasia hematológica más frecuente, después del linfoma no Hodgkin y constituye, aproximadamente, el 10% de todas las neoplasias hematológicas, y el 1% de todos los cánceres y causa el 2% de las muertes por cáncer. El sorafenib es un inhibidor de múltiples quinasas diseñado originalmente como inhibidor de la vía de las MAPK. Debido que la actividad de ERK es esencial para la proliferación de las células de mieloma múltiple mediada por la IL-6, se analizó en detalle el efecto de este fármaco en células de mieloma múltiple. El sorafenib, a concentraciones alcanzadas en clínica, induce apoptosis en líneas celulares de mieloma múltiple, en células plasmáticas mielomatosas de pacientes de mieloma múltiple y reduce el crecimiento de tumores desarrollados en ratones nude. La apoptosis se caracterizó por caída del potencial mitocondrial, exposición de fosfatiodilserina, activación de caspasas, liberación de citocromo c y condensación de la cromatina. El sorafenib no cambió, de manera significativa, los niveles de la proteína proapoptótica sólo-BH3 Bim pero aumentó los niveles de Puma lo cual se apreció claramente en presencia del inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk, así como un aumento en los niveles de su mRNA detectados tanto por RT-MLPA como por Real-time PCR. También indujo una marcada reducción de los niveles de las proteínas antiapoptóticas Bcl-xL y Mcl-1, lo cual parece ser mediado por las caspasas. Z-VAD-fmk inhibe de manera variable los fenotipos apoptóticos inducido por el sorafenib, por lo que bloque la muerte celular de forma dependiente de la línea. La sobre expresión de Bcl-xL y en menor medida de Mcl-1, así como el silenciamiento de Puma, Bax y Bak disminuyen significativamente la muerte celular inducida por el sorafenib. Sin embargo, este fármaco continúa induciendo muerte en estas células resistente a la apoptosis. El sorafenib también induce autofagia, el cual tiene un efecto citoprotector en las células silvestre de mieloma múltiple pero contribuye a la muerte en células que sobreexpresan Bcl-xL. La combinación de sorafenib con el inhibidor del proteosoma bortesomib presenta unos resultados ambiguos, en células como las RPMI 8226 presenta un efecto sinérgico, en cambio en las restante líneas ensayadas el efecto es antagónico o ligeramente aditivo, en cambio al combinar el sorafenib con otros fármacos como el ligando mortal APO2L/TRAIL, inhibidores de mTOR PP242 y OSI-027 o el inhibidor de JAK1/2 ruxolitinib, se observa un marcado efecto sinérgico. Además el sorafenib parece aumentar la expresión de la enzima ALDH1A1, enzima cuya expresión se encuentra también aumentada en células madres, tanto normales como tumorales y actúa como mecanismo de detoxificación celular

Estudio de las interacciones entre proteínas anti- y proapoptóticas de la familia Bcl-2 en células vivas mediante BiFC

La proteína PUMA ha sido propuesta como un importante regulador en la vía mitocondrial de la apoptosis. Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual PUMA y otras proteínas sólo-BH3 regulan la apoptosis, especialmente cómo activan a las proteínas Bax y Bak, es todavía controvertido. Estudios previos han analizado las interacciones entre proteínas de la familia Bcl-2 in vitro. En este estudio, mediante la técnica BiFC, fuimos capaces de crear dos líneas celulares estables de HeLa con PUMA y Bcl-xL y con PUMA y Mcl-1 con el fin de investigar las interacciones entre estas proteínas apoptóticas y antiapoptóticas directamente en células humanas vivas. Nuestros resultados indican que estas interacciones también se producen en células vivas, siendo más fuerte la interacción entre PUMA y Bcl-xL que entre PUMA y Mcl-1

Evolving trends in the management of acute appendicitis during COVID-19 waves. The ACIE appy II study

Background: In 2020, ACIE Appy study showed that COVID-19 pandemic heavily affected the management of patients with acute appendicitis (AA) worldwide, with an increased rate of non-operative management (NOM) strategies and a trend toward open surgery due to concern of virus transmission by laparoscopy and controversial recommendations on this issue. The aim of this study was to survey again the same group of surgeons to assess if any difference in management attitudes of AA had occurred in the later stages of the outbreak. Methods: From August 15 to September 30, 2021, an online questionnaire was sent to all 709 participants of the ACIE Appy study. The questionnaire included questions on personal protective equipment (PPE), local policies and screening for SARS-CoV-2 infection, NOM, surgical approach and disease presentations in 2021. The results were compared with the results from the previous study. Results: A total of 476 answers were collected (response rate 67.1%). Screening policies were significatively improved with most patients screened regardless of symptoms (89.5% vs. 37.4%) with PCR and antigenic test as the preferred test (74.1% vs. 26.3%). More patients tested positive before surgery and commercial systems were the preferred ones to filter smoke plumes during laparoscopy. Laparoscopic appendicectomy was the first option in the treatment of AA, with a declined use of NOM. Conclusion: Management of AA has improved in the last waves of pandemic. Increased evidence regarding SARS-COV-2 infection along with a timely healthcare systems response has been translated into tailored attitudes and a better care for patients with AA worldwide

Aspectos éticos y legales del dopaje en el deporte

La posibilidad de utilizar sustancias o métodos para aumentar el rendimiento en el deporte tiene hoy día tal importancia que todos los responsables tanto a nivel educativo, político-sanitario como deportivo han de hacer un esfuerzo suplementario para evitar que este problema siga creciendo de forma incontrolada, en aras de proteger la salud del deportista no sólo de alto rendimiento sino también de evitar que los niños y adolescentes vean esta opción como una manera de tener preponderancia y estima social de fácil consecución, y favorecer el juego limpio educando en la cultura de la ética deportiva. De ahí que en los últimos años haya crecido, desde un punto de vista legal, la forma de controlar, detectar y sancionar y/o reprimir este posible engaño, aunque todavía falte mucho camino por recorrer. Al respecto, no olvidemos lo que se nos avecina con la posibilidad, ya real, del "dopaje genético", actualmente imposible de detectar y al que ya se han apuntado, por desgracia, muchos deportistas con tal de llegar a la gloria de las medallas o de conseguir batir un récord. Esta revisión bibliográfica pretende llamar la atención sobre el problema del "dopaje en el deporte" y ponernos al día sobre la legislación existente para intentar neutralizarlo

El Quijote en el mundo

Resumen basado en el de los autores. Los CDs contienen: la página web del proyecto, dos presentaciones en PowerPoint, 4 vídeos y un programa de radio. Como anexos se presenta un cartel, un tríptico, un logo-pegatina, marcadores, un programa de actividades y un dossier de prensa. Convocatoria de Premios Nacionales de Investigación e Innovación Educativa 2005. Modalidad de Innovación Educativa. Mención HonoríficaProyecto educativo llevado a cabo en el IES Mencey Acaymo de Güímar (Tenerife) que consiste en la construcción de un museo dedicado a la obra de Cervantes, coincidiendo con el IV centenario de la primera edición de El Quijote. Para la constitución del museo se han recavado 300 ediciones distintas de dicha obra en diferentes lenguas e idiomas. Paralelamente se desarrollaron en el contexto de la celebración de la 'semana de contenidos' diferentes actividades como lecturas de la obra, una ruta literaria por sus lugares más emblemáticos, actuaciones, conferencias, exposiciones temáticas en torno a la época del Quijote realizadas por los propios alumnos, talleres-concursos, un programa de radio. Los objetivos del proyecto son: 1.Fomentar la aplicación en el aula de experiencias educativas en el campo de la transversalidad y la construcción de valores, contemplada como una educación para la vida, para el desarrollo personal y social del alumnado. 2.Mejorar el ambiente escolar desde el desarrollo de proyectos que integren a todos los sectores de la comunidad educativa de los centros.3.Fomentar la adquisición de capacidades básicas en el alumnado a través de proyectos y planes de desarrollo del hábito lector, animación a la lectura y dinamización de bibliotecas en los centros educativos. 4.Favorecer la inmersión lingüística en el ámbito del aprendizaje de lenguas extranjeras, ya que la colección posee ediciones de diferentes idiomas. 5.Aplicar didácticas y metodologías innovadoras para la enseñanza y el aprendizaje de las distintas áreas y asignaturas del currículo.CanariasBiblioteca de Educación del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte; Calle San Agustín, 5 - 3 Planta; 28014 Madrid; Tel. +34917748000; Fax +34917748026; [email protected]