Interplay of orientational order and roughness in simulated thin film growth of anisotropically interacting particles

Roughness and orientational order in thin film films of anisotropic particles are investigated using kinetic Monte Carlo simulations on a cubic lattice. Anisotropic next-neighbor attractions between the lattice particles were chosen to mimic the effects of shape anisotropy in the interactions of disc- or rod-like molecules with van-der-Waals attractions. Increasing anisotropy leads first to a preferred orientation in the film (which is close to the corresponding equilibrium transition) while the qualitative mode of roughness evolution (known from isotropic systems) does not change. At strong anisotropies, a non-equilibrium roughening effect is found, accompanied by re-ordering in the film which can be interpreted as the nucleation and growth of domains of lying-down discs or rods. The information on order and roughness is combined into a diagram of dynamic growth modes.Comment: 13 pages, 19 figure

Structural insights and biomedical potential of IgNAR scaffolds from sharks

Peer reviewedPublisher PD

Clinical and Genetic Evaluation of Patients with KATP Channel Mutations from the German Registry for Congenital Hyperinsulinism

Congenital hyperinsulinism (CHI) causes hypoglycemia due to irregular insulin secretion. In infants, a rapid diagnosis and appropriate management to avoid severe hypoglycemia is mandatory. CHI is a heterogeneous condition at the clinical and genetic level, and disease-causing genes have been identified in about half of the patients. The majority of mutations have been identified in the ABCC8 and KCNJ11 genes encoding subunits of the KATP channel responsible for two distinct histological forms. The diffuse form is caused by autosomal recessive or dominant inherited mutations, whereas the focal form is caused by a paternally transmitted recessive mutation and a second somatic event. We report on an unselected cohort of 136 unrelated patients from the German CHI registry. Mutations in either the ABCC8 or KCNJ11 gene were identified in 61 of these patients (45%). In total, 64 different mutations including 38 novel ones were detected in this cohort. We observed biparental (recessive) inheritance in 34% of mutation-positive patients, dominant inheritance in 11% and paternal transmission of a mutation associated with a focal CHI type in 38%. In addition, we observed inheritance patterns that do not exactly follow the classical recessive or dominant mode, further adding to the genetic complexity of this disease

Micro-rheological properties of lung homogenates correlate with infection severity in a mouse model of Pseudomonas aeruginosa lung infection

Lung infections caused by Pseudomonas aeruginosa pose a serious threat to patients suffering from, among others, cystic fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease, or bronchiectasis, often leading to life-threatening complications. The establishment of a chronic infection is substantially related to communication between bacteria via quorum-sensing networks. In this study, we aimed to assess the role of quorum-sensing signaling molecules of the Pseudomonas quinolone signal (PQS) and to investigate the viscoelastic properties of lung tissue homogenates of PA-infected mice in a prolonged acute murine infection model. Therefore, a murine infection model was successfully established via intra-tracheal infection with alginate-supplemented Pseudomonas aeruginosa NH57388A. Rheological properties of lung homogenates were analyzed with multiple particle tracking (MPT) and quorum-sensing molecules were quantified with LC–MS/MS. Statistical analysis of bacterial load and quorum-sensing molecules showed a strong correlation between these biomarkers in infected lungs. This was accompanied by noticeable changes in the consistency of lung homogenates with increasing infection severity. Furthermore, viscoelastic properties of the lung homogenates strongly correlated with bacterial load and quorum sensing molecules. Considering the strong correlation between the viscoelasticity of lung homogenates and the aforementioned biomarkers, the viscoelastic properties of infected lungs might serve as reliable new biomarker for the evaluation of the severity of P. aeruginosa infections in murine models

Tackling pseudomonas aeruginosa virulence by a hydroxamic acid-absed LasB inhibitor

In search of novel antibiotics to combat the challenging spread of resistant pathogens, bacterial proteases represent promising targets for pathoblocker development. A common motif for protease inhibitors is the hydroxamic acid function, yet this group has often been related to unspecific inhibition of various metalloproteases. In this work, the inhibition of LasB, a harmful zinc metalloprotease secreted by Pseudomonas aeruginosa, through a hydroxamate derivative is described. The present inhibitor was developed based on a recently reported, highly selective thiol scaffold. Using X-ray crystallography, the lack of inhibition of a range of human matrix metalloproteases could be attributed to a distinct binding mode sparing the S1′ pocket. The inhibitor was shown to restore the effect of the antimicrobial peptide LL-37, decrease the formation of P. aeruginosa biofilm and, for the first time for a LasB inhibitor, reduce the release of extracellular DNA. Hence, it is capable of disrupting several important bacterial resistance mechanisms. These results highlight the potential of protease inhibitors to fight bacterial infections and point out the possibility to achieve selective inhibition even with a strong zinc anchor

Phage display-based discovery of cyclic peptides against the broad spectrum bacterial anti-virulence target CsrA

Small macrocyclic peptides are promising candidates for new anti-infective drugs. To date, such peptides have been poorly studied in the context of anti-virulence targets. Using phage display and a self-designed peptide library, we identified a cyclic heptapeptide that can bind the carbon storage regulator A (CsrA) from Yersinia pseudotuberculosis and displace bound RNA. This disulfide-bridged peptide, showed an IC50 value in the low micromolar range. Upon further characterization, cyclisation was found to be essential for its activity. To increase metabolic stability, a series of disulfide mimetics were designed and a redox-stable 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole analogue displayed activity in the double-digit micromolar range. Further experiments revealed that this triazole peptidomimetic is also active against CsrA from Escherichia coli and RsmA from Pseudomonas aeruginosa. This study provides an ideal starting point for medicinal chemistry optimization of this macrocyclic peptide and might pave the way towards broadacting virulence modulators

In-depth Profiling of MvfR-Regulated Small Molecules in Pseudomonas aeruginosa after Quorum Sensing Inhibitor Treatment

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative bacterium, which causes opportunistic infections in immuno-compromised individuals. Due to its multiple resistances toward antibiotics, the development of new drugs is required. Interfering with Quorum Sensing (QS), a cell-to-cell communication system, has shown to be highly efficient in reducing P. aeruginosa pathogenicity. One of its QS systems employs Pseudomonas Quinolone Signal (PQS) and 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HHQ) as signal molecules. Both activate the transcriptional regulator MvfR (Multiple Virulence Factor Regulator), also called PqsR, driving the production of QS molecules as well as toxins and biofilm formation. The aim of this work was to elucidate the effects of QS inhibitors (QSIs), such as MvfR antagonists and PqsBC inhibitors, on the biosynthesis of the MvfR-regulated small molecules 2′-aminoacetophenone (2-AA), dihydroxyquinoline (DHQ), HHQ, PQS, and 4-hydroxy-2-heptylquinoline-N-oxide (HQNO). The employed synthetic MvfR antagonist fully inhibited pqs small molecule formation showing expected sigmoidal dose-response curves for 2-AA, HQNO, HHQ and PQS. Surprisingly, DHQ levels were enhanced at lower antagonist concentrations followed by a full suppression at higher QSI amounts. This particular bi-phasic profile hinted at the accumulation of a biosynthetic intermediate resulting in the observed overproduction of the shunt product DHQ. Additionally, investigations on PqsBC inhibitors showed a reduction of MvfR natural ligands, while increased 2-AA, DHQ and HQNO levels compared to the untreated cells were detected. Moreover, PqsBC inhibitors did not show any significant effect in PA14 pqsC mutant demonstrating their target selectivity. As 2-AA is important for antibacterial tolerance, the QSIs were evaluated in their capability to attenuate persistence. Indeed, persister cells were reduced along with 2-AA inhibition resulting from MvfR antagonism, but not from PqsBC inhibition. In conclusion, antagonizing MvfR using a dosage capable of fully suppressing this QS system will lead to a favorable therapeutic outcome as DHQ overproduction is avoided and bacterial persistence is reduced

A New PqsR Inverse Agonist Potentiates Tobramycin Efficacy to Eradicate Pseudomonas aeruginosa Biofilms

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections can be notoriously difficult to treat and are often accompanied by the development of antimicrobial resistance (AMR). Quorum sensing inhibitors (QSI) acting on PqsR (MvfR) – a crucial transcriptional regulator serving major functions in PA virulence – can enhance antibiotic efficacy and eventually prevent the AMR. An integrated drug discovery campaign including design, medicinal chemistry-driven hit-to-lead optimization and in-depth biological profiling of a new QSI generation is reported. The QSI possess excellent activity in inhibiting pyocyanin production and PqsR reporter-gene with IC50 values as low as 200 and 11 × 10−9 m, respectively. Drug metabolism and pharmacokinetics (DMPK) as well as safety pharmacology studies especially highlight the promising translational properties of the lead QSI for pulmonary applications. Moreover, target engagement of the lead QSI is shown in a PA mucoid lung infection mouse model. Beyond that, a significant synergistic effect of a QSI-tobramycin (Tob) combination against PA biofilms using a tailor-made squalene-derived nanoparticle (NP) formulation, which enhance the minimum biofilm eradicating concentration (MBEC) of Tob more than 32-fold is demonstrated. The novel lead QSI and the accompanying NP formulation highlight the potential of adjunctive pathoblocker-mediated therapy against PA infections opening up avenues for preclinical development

Disubstituted 1,2,3-Triazoles: A Multitool for Biomolecular Chemistry

Der zentrale chemische Baustein der vorliegenden kumulativen Dissertation ist der 1,2,3-Triazol und dessen unterschiedliche Anwendungsmöglichkeiten in der Peptidchemie. Die hier präsentierten Studien können grob in zwei Teilgebiete eingeordnet werden: Gerüstmolekül-basierte Multimerisierung peptidischer Liganden durch Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin Cycloaddition (CuAAC) und der Einsatz von 1,2,3-Triazolen als nichtnatürliche Struktur¬bausteine von Peptidomimetika. Der zweite Themenkomplex umfasst sowohl den biomimetischen Ersatz von Peptidrückgratelementen als auch die Substitution von makrozyklischen und linearen Seitenkettenmotiven. Hierfür kam zusätzlich zu der genannten CuAAC-Chemie auch eine Ruthenium(II)-katalysierte Variante (RuAAC) zum Einsatz. Die genannten synthetischen Methoden wurden erfolgreich für die Synthese verschiedener Triazol-haltiger peptidischer Substanzen angewendet und hinsichtlich der Durchführung in Lösung vor allem aber auch an der festen Phase vorangebracht. Experimente zur Konstruktion wohldefinierter multivalenter Biokonjugate wurden mit fünf unterschiedlichen Peptidliganden und zwei regioselektiv addressierbaren funktionalisierten Platformmolekülen so genannten RAFT (regioselectively addressable functionalized template) durchgeführt. Die CuAAC-Kupplung gelang mit stöchiometrischer Konversion der Edukte zu den gewünschten verzweigten Peptidoligomeren und lieferte moderate bis gute Ausbeuten. Eines der synthetisierten Konstrukte beinhaltete vier Kopien einer „RGD“ Sequenz und zusätzlich einen Fluoreszenzmarker. Die genannten bioaktiven Peptidliganden können den GPIIb/IIIa Rezeptor binden und dadurch die Aggregation von Bltuplättchen inhibieren. Somit könnte dieses Gerüstmolekül-basierte multivalente Konstrukt für Fluoreszenzmikroskopie von GPIIb/IIIa-exprimierenden Zellen geeignet sein. Allerdings wurden keine detaillierten biologischen Untersuchungen mit diesem Biokonjugat durchgeführt, da ohnehin nur mit einem sehr geringen therapeutischen bzw. diagnostischen Nutzen zu rechnen ist. Desweiteren bleibt anzumerken, dass bis zum heutigen Zeitpunkt fortschrittlichere Biokonjuga¬tionsmethoden entwickelt worden sind, die nicht der Übergangsmetallkatalyse bedürfen. Dennoch stellt die beschriebene Studie eine Blaupause für die erfolgreiche Synthese heteromultivalenter Peptidkonjugate dar. Die berichtete Methode wird unter anderem weiterhin in der Arbeitsgruppe von Prof. Kolmar in verschiedenen Projekten zum Aufbau Gerüstmolekül-basierter Konstrukte mit anderen Peptidliganden verwendet, die therapeutisches oder diagnostisches Potential besitzen. Eine weitere sehr vielversprechende Anwendung von 1,2,3-Triazolen beruht auf den besonderen physikochemischen Eigenschaften dieser stickstoffhaltigen aromatischen Heterozyklen. Sie können in Wasserstoffbrückenbindungen sowohl als Akzeptoren als auch Donatoren wirken, sind polar und besitzen eine gute Wasserlöslichkeit. Diese Faktoren und die Möglichkeit, selektiv 1,4- oder 1,5-disubstituierte 1,2,3-Triazole durch die Wahl des Übergangsmetallkatalysators der verwendeten Azid-Alkin Zykloaddition auszubauen, machen diese Baueinheit zu einem geeigneten nichtnatürlichen Ersatz von Amidbindungen. Es ist somit möglich, das Peptidrückgrat durch ein Hydrolyse-resistentes Biomimetikum zu ersetzen und darüber hinaus entweder in der trans- oder der cis-Konformation einzufrieren. Dieses Konzept wurde für das Design und die Synthese von peptidomimetischen Varianten des monozyklischen sunflower trypsin inhibitor-1 (SFTI-1[1,14]) herangezogen. Zu diesem Zweck wurde eine Strategie verwendet, welche Mikrowellen-unterstützte Fmoc-basierte Peptidfestphasensynthese (Fmoc-SPPS) mit CuAAC- oder RuAAC-Kupplungen an der festen Phase kombinierte. Die gewünschten Verbindungen konnten so in ausreichenden Mengen synthetisiert werden, um damit sowohl strukturelle Untersuchungen als auch in vitro Inhibitionstests durchzuführen. Die gelösten Kristallstrukturen von Trypsin-Inhibitor-Komplexen durch Röntgenbeugungsexperimente beweisen die erfolgreiche Synthese der funktionalen Peptidomimetika mit nichtnatürlichen Rückgratelementen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass mit diesem Ansatz auch die der nativen Struktur entgegenstehenden Amidkonformationen erzwungen werden können. Somit kann zum Beispiel an einer ausgewählten Stelle in der Aminosäurensequenz ein cis-Mimetikum installiert werden. Dieses ist insofern bemerkenswert, als cis-Peptidbindungen sehr selten in der Natur zu finden sind und meist nur vor Prolinresten auftreten. Diese Technik ermöglicht es demnach, neue peptidische Strukturen zu erzeugen, die mit dem kanonischen Repertoire nicht erreichbar wären. Wie erwartet führte das „Einfrieren“ einer dem natürlichen Rückgrat gegensätzlichen Amidkonformation beim SFTI-1 zu einer signifikant verminderten Bioaktivität. Schließlich gibt einem diese Methode die Möglichkeit an die Hand, bestimmte Peptidsegmente in einem Molekül gegen enzymatische Degradation zu schützen, was zu einer verbesserten in vivo Stabilität führen sollte. Zwei weitere Studien hatten zum Inhalt, den Effekt von 1,2,3-Triazol-basierten Disulfidaustauschen auf die Bioaktivität von SFTI-1[1,14] zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden vier Seitenkettenmakrozyklisierungsmotive unterschiedlicher Länge und Form anstatt des natürlichen Cystins mittels kommerziell erhältlicher Bausteine installiert. Wieder kam einer Kombination aus Fmoc-SPPS und CuAAC oder RuACC an der festen Phase zum Einsatz. Die intramolekulare Reaktion ergab die gewünschten Triazole-verbrückten peptidomime¬tischen Verbindungen mit einem 1,4- oder einem 1,5-Disubstitutionsmuster. Die reinen Produkte wurden sowohl mittels Infrarot- und 2D-Kernresonanzspektroskopie als auch durch Massenspektrometrie (Elektrospray-Ionisation) charakterisiert. In vitro Inhibitionsunter¬suchungen zeigten, dass die Substitutionsart des Makrozyklisierungsmotivs einen dramatischen Einfluss auf die Bioaktivität hatte. Interessanterweise waren die Varianten mit einem 1,5-Muster potente Trypsininhibitoren und besaßen Substrat-unabhängige Inhibitionskonstanten Ki im einstellig nanomolaren bis subnanomolaren Bereich. Die 1,4-Gegenstücke hingegen zeigten eine signifikant verminderte Bioaktivität im Vergleich zum Wildtyp. Die Länge der verbrückenden Einheit zwischen dem Peptidrückgrat und dem Triazolebaustein hatte einen nicht so entscheidenden Einfluss. Diese in vitro-Ergenisse wurden durch molekulare Modellierung bestätigt, da in diesen in silico Experimenten eine bessere Übereinstimmung mit der Struktur des nativen Peptids für das RuAAC-Produkt beobachtet wurde. Somit wird die Verwendung von 1,5-disubstituierten 1,2,3-Triazolen als Disulfidbrückenersatz empfohlen. Allerdings sollte die geeignete Länge des Makrozyklisier¬ungsmotivs für jeden biologischen Kontext neu evaluiert werden. Sowohl die vier SFTI-1-Derivate mit „Triazolbrücken“ als auch die beiden nativen mono- und bizyklischen Varianten wurden auf ihre Aktivität gegen die pharmazeutisch relevante Protease Matriptase getestet. Überraschenderweise wurde für alle sechs genannten Peptide eine dramatisch schlechtere Affinität als gegen Trypsin gemessen. Diese Beobachtung war unerwartet, da ein negatives elektrostatisches Oberflächenpotential am aktiven Zentrum von Matriptase Anlass für ausgeprägte attraktive Wechselwirkungen zwischen dem positiv geladenen SFTI-1-Gerüst und dem Enzym geben sollte. Um dieses kontraintuitive Ergebnis weiter zu untersuchen, wurde ein in silico Experiment mit Hilfe der Software YASARA structure und einem angepassten AMBER-basierten Kraftfeld in zwei Schritten durchgeführt. Zuerst, wurde eine Molekulardynamik Simulation durchgeführt. Danach wurden 100 Einzelstrukturen aus den erhaltenen Trajektorien für ein lokales Docking Experiment extrahiert. Durch den zugrundeliegenden AUTODOCK-Algorithmus konnten so die freien Bindungsenergien für alle Inhibitor-Enzym-Komplexe berechnet werden. In der Tat deuteten die in silico Affinitäten auf eine stärkere Interaktion zwischen dem SFTI-1-Gerüst und Matriptase im Vergleich zur Bindung an Trypsin hin. Allerdings wurde im Vergleich zu Trypsin eine erheblich reduzierte Rate, die obligatorische canonische Orientierung im aktiven Zentrum des Enzyms zu treffen, bei den Docking Experimenten gegen Matriptase ermittelt. Eine Normalisierung der berechneten freien Bindungsenergien mit Hilfe dieses Hitfaktors gab die tatsächlich gemessenen Affinitäten aus den in vitro Assays relativ gut wieder. Eine anschließende Strukturanalyse der simulierten Trajektorien und die Berechnung der Wurzel der mittleren quadratischen Abweichung (root-mean-square deviation, RMSD) einzelner Segmente der jeweiligen SFTI-1-Varianten gaben Anlass zu der Vermutung, dass negative entropische Beiträge, die ihren Ursprung in den terminalen Regionen der Peptide haben, die generell reduzierte Bioaktivität gegen Matriptase verursachen. Die Ergebnisse der in silico Untersuchungen lieferten wertvolle Hinweise für mögliche Strategien zur Optimierung des Inhibitors gegen die pharmazeutisch relevante Serinprotease, welche in einer weiteren Studie untersucht wurden. Es wurde beobachtet, dass die offenkettige Variante von SFTI-1 (SFTI-1[1,14]) eine leichte Präferenz in ihrer Anti-Matriptase-Wirkung gegen über dem bizyklischen Wildtyp zeigte. Somit war dieses monozyklische Peptid ein geeigneter Startpunkt für die weiteren Versuche. Struktur-geleitete Überlegungen führten zu der Identifikation von drei Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz, die potentiell für inkrementelle verteilhafte Modifikationen geeignet waren. Zwei dieser Reste wurden jeweils mit Azid-funktionalisierten nichtnatürlichen Baueinheiten ausgestattet, um eine divergente Synthese mittels eines kombinatorischen Ansatzes zu ermöglichen. Zusätzlich wurden auch Substitutionen mit ausgewählten kanonischen Aminosäuren durchgeführt. Zusammen ermöglichte dies den raschen Aufbau einer kleinen Molekülbibliothek mit 22 Peptiden, die sich durch jeweils eine einzelne andere Seitenkettenmodifikation unterschieden. Matriptaseinhibitionstests wiesen auf mehrere vorteilhafte Seitenkettenaustausche hin. Diejenigen Modifikationen mit den ausgeprägtesten Verbesserungen wurden in einer Verbindung vereint, welche eine Ki im einstellig nanomolaren Bereich besaß. Dieses Peptid wurde SFTI-1-derived matriptase inhibitor-1 (SDMI-1) genannt und beinhaltete ausschließlich Standardaminosäuren. Dennoch wurden auch signifikante Affinitätsverbesserungen für einzelne Triazol-haltige Verbindungen gegen Matriptase beobachtet. Dies zeigte die Nützlichkeit dieses Ansatzes einer „Click-Bibliothek“ für die rasche Sondierung diverser Seitenkettenfunktionalitäten hinsichtlich bestimmter gewünschter Eigenschaften. Wie bereits erwähnt könnte ein möglicher nachteilbehafteter entropischer Beitrag durch die Sekundärschleife von SFTI-1 die Bindung an Matriptase beeinflusst haben. Deshalb wurden die zwei C-terminalen Reste von SDMI-1 in einer weiteren Variante trunkiert. Dieses Dodecapeptid wurde SDMI-2 genannt und besaß eine vergleichbare Aktivität wie SDMI-1. Darüber hinaus wurde ein verbessertes Selektivitätsprofil für das kürzere Peptid festgestellt, da es eine sechsfach schlechtere Aktivität gegen Trypsin als gegen Matriptase zeigte. Die entwickelten Verbindungen könnten wertvolle Peptidliganden für weitere Biokonjugationseperimente darstellen und werden derzeit auf eine mögliche Patentanmeldung geprüft. So zum Beispiel würde die direkte Ankopplung von Radionukliden, welche für Positronenemissions- oder Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (positron emission tomography PET, single-photon emission computed tomography SPECT) geeignet sind, evtl. eine Anwendung als diagnostische Werkzeuge für in vivo Bildgebung ermöglichen. Desweiteren ist das Potential für weitere Affinitäts- und Selektivitätsverbesserungen in Bezug auf Matriptase oder auch andere Proteasen von pharmazeutischer Relevanz noch nicht erschöpft. Die in dieser kumulativen Dissertation vorgestellten und durch Fachleute begutachteten Artikel tragen dazu bei einen vielseitigen Werkzeugkasten für das Design und die Synthese von peptidomimetischen Verbindungen mit Hilfe von disubstituierten 1,2,3-Triazolen aufzubauen. Die vorgestellten Ergebnisse sind von Interesse für die biomolekulare Chemie im Allgemeinen und die Peptidchemie im Speziellen sein

KSHV-specific antivirals targeting the protein-DNA interaction of the latency-associated nuclear antigen.

The Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is an oncogenic human herpesviruses that is responsible for cancer, especially in immunosuppressed people, such as patients with AIDS. So far, there are no KSHV-specifc antiviral agents available. In this review, we provide an overview on one particular target-centered approach toward novel anti-KSHV drugs focusing on interfering with the molecular functions of the latency-associated nuclear antigen (LANA). This review focuses on attempts to interfere with the LANA-DNA interaction mediated by the C-terminal domain. We describe the drug discovery approaches chosen for this endeavor as well as molecular structures that were identified in this innovative concept toward novel and KSHV-specific antiherpesviral agents